含鉭殼聚糖支架在骨質(zhì)疏松性骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OS)是一種以骨代謝異常為特征的系統(tǒng)性骨病，代謝異常導(dǎo)致骨的再生能力下降，進(jìn)而產(chǎn)生延遲愈合、骨不連，甚至引起骨缺損。在骨質(zhì)疏松癥的診療方面，全球范圍內(nèi)投入的醫(yī)療費(fèi)用及社會(huì)資源非?？捎^，而且伴隨著世界人口老齡化的步伐，這種投入還在繼續(xù)攀升。骨質(zhì)疏松癥合并骨缺損更是困擾臨床工作的難題之一。雖然國(guó)內(nèi)外的專家學(xué)者們已經(jīng)開發(fā)出多種類型的組織工程支架，但是目前尚未找到一種理想的支架。
　　理想的組織工程支

2、架應(yīng)該達(dá)到以下要求:支架應(yīng)具有促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖的能力;支架的降解產(chǎn)物不產(chǎn)生炎癥或毒性;支架應(yīng)能提供合適的機(jī)械支撐，以避免細(xì)胞被破壞性的壓縮和拉伸;支架應(yīng)能促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，以增強(qiáng)骨的再生能力。目前研究較為廣泛的組織工程材料包括:天然有機(jī)聚合物:膠原蛋白、纖維蛋白、殼聚糖等;天然無(wú)機(jī)聚合物:珊瑚羥基磷灰石、陶瓷化骨等;人工合成有機(jī)聚合物:聚乳酸、聚羥基乙酸;人工合成聚合物:羥基磷灰石、磷酸三鈣;金屬材料:鈦、鉭等。
　　殼聚糖是一

3、種堿性氨基多糖，由甲殼素脫乙?；苽涠桑浣Y(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似氨基多糖，而氨基多糖正是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分。殼聚糖的生物相容性良好，而且降解產(chǎn)物無(wú)毒性作用，但是作為組織工程支架材料，殼聚糖的缺點(diǎn)在于其力學(xué)性能和成骨能力的不足。力學(xué)性能不足導(dǎo)致其無(wú)法為承重部位提供有效的機(jī)械支撐，成骨能力不足使其難以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)。為了解決這一問(wèn)題，許多學(xué)者進(jìn)行了制備復(fù)合材料的嘗試。Bayer等制備了磷酸鈣與殼聚糖組成的聚合物，形成類似骨組織的

4、結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)調(diào)整材料的成分比例改變其部分性能，然而這種支架的彈性模量較低，力學(xué)支撐不足，而且對(duì)于這種支架材料的成骨能力也未做進(jìn)一步研究。因此，與殼聚糖組成聚合物的材料，應(yīng)該具有更高的彈性模量，以及更好的成骨能力。鉭具有更高的彈性模量，同時(shí)具有較強(qiáng)的成骨能力，而且生物相容性良好，然而，鉭材料由于比重大、過(guò)于致密等缺點(diǎn)，無(wú)法直接植入人體中。
　　因此，我們對(duì)殼聚糖支架進(jìn)行改良，制備成含鉭殼聚糖復(fù)合支架。鉭材料較高的彈性模量、較強(qiáng)的成

5、骨能力能否彌補(bǔ)殼聚糖材料在力學(xué)性能與成骨能力方面的不足？復(fù)合支架能否達(dá)到修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨缺損所需的機(jī)械支撐和成骨能力？本研究將對(duì)含鉭殼聚糖復(fù)合支架的力學(xué)性能、生物學(xué)特性以及動(dòng)物體內(nèi)骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)能力進(jìn)行分析探討。
　　目的：
　　1.對(duì)含鉭殼聚糖復(fù)合支架的力學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.對(duì)含鉭殼聚糖復(fù)合支架影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖及成骨分化的能力進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估支架的生物學(xué)特性。
　　3.利用骨質(zhì)疏松

6、兔模型檢測(cè)含鉭殼聚糖復(fù)合支架修復(fù)動(dòng)物體內(nèi)骨質(zhì)疏松性骨缺損的能力。
　　方法：
　　1.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架的力學(xué)性能，使用ElectroForce3100Test Instrument測(cè)出支架的載荷——位移曲線。對(duì)曲線初始階段相對(duì)平滑的線性部分進(jìn)行分析，并計(jì)算出支架的彈性模量(E)。
　　2.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架的生物學(xué)特性，將大鼠BMSCs置于含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換培

7、養(yǎng)液，匯合后用0.25％胰酶消化，再用含血清的培養(yǎng)基中止消化，并制備細(xì)胞懸液。
　　3.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對(duì)大鼠BMSCs粘附的影響，培養(yǎng)的大鼠BMSCs分別接種至殼聚糖支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架上。在1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別使用CCK-8法于450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，間接反映支架對(duì)細(xì)胞粘附的影響。
　　4.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對(duì)大鼠BMSCs增殖的影響，將培養(yǎng)的大鼠BMSCs分別接種至殼聚糖

8、支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架上，使用CCK-8法在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)和120小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)450nm波長(zhǎng)處的OD值進(jìn)行測(cè)量。
　　5.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對(duì)大鼠BMSCs成骨分化的影響，培養(yǎng)的大鼠BMSCs分別接種至殼聚糖支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架上，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在成骨誘導(dǎo)后第7、14天進(jìn)行ALP染色，第21、28天進(jìn)行茜素紅染色，以評(píng)估細(xì)胞的礦化程度。成骨誘導(dǎo)后第7、14、21、28天分別對(duì)

9、樣本礦化時(shí)所吸收的鈣離子濃度進(jìn)行定量分析，間接反映支架對(duì)成骨分化的影響。成骨誘導(dǎo)第28天后，Real-time PCR測(cè)定成骨相關(guān)基因表達(dá)，Western blot法測(cè)定成骨相關(guān)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　6.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對(duì)骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)能力，將骨質(zhì)疏松兔隨機(jī)分為2組，在腰椎椎體制造骨缺損，然后分別將殼聚糖支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架植入骨缺損部位。12周后取出椎體，使用Micro-CT對(duì)標(biāo)本進(jìn)行掃描，并對(duì)支架周圍的骨小

10、梁數(shù)量、骨體積分?jǐn)?shù)、骨密度、骨小梁厚度進(jìn)行檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析。用1％甲苯胺藍(lán)對(duì)標(biāo)本的硬組織切片進(jìn)行染色后，鏡下觀察，并對(duì)骨面積分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.復(fù)合支架力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果
　　復(fù)合支架力學(xué)性能良好。復(fù)合支架的彈性模量為3.07±0.12GPa，殼聚糖支架的彈性模量為2.38±0.69GPa，復(fù)合支架的彈性模量高于殼聚糖支架，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.復(fù)合支架對(duì)骨髓間充

11、質(zhì)干細(xì)胞粘附的影響
　　復(fù)合支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附具有更好的促進(jìn)作用。在第1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞在復(fù)合支架表面的粘附能力均高于殼聚糖支架，并且差異逐漸增大。
　　3.復(fù)合支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響
　　復(fù)合支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖具有更好的促進(jìn)作用。在第24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞在復(fù)合支架表面的增殖能力均高于殼聚糖支架，并且差異逐漸增大。<

12、br>　　4.復(fù)合支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響
　　復(fù)合支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化具有更好的促進(jìn)作用。含鉭殼聚糖復(fù)合支架表面細(xì)胞的堿性磷酸酶陽(yáng)性水平、鈣結(jié)節(jié)顆粒數(shù)量明顯高于殼聚糖支架，從更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的第7天開始，復(fù)合支架表面細(xì)胞的鈣離子吸收濃度均大于殼聚糖支架，并且差異逐漸增大。成骨誘導(dǎo)第28天后，Real-time PCR測(cè)定復(fù)合支架表面細(xì)胞的成骨相關(guān)基因表達(dá)高于殼聚糖支架，Western blot法測(cè)定復(fù)合

13、支架表面細(xì)胞的成骨相關(guān)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)高于殼聚糖支架3-5倍。
　　5.復(fù)合支架修復(fù)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型骨缺損的能力
　　復(fù)合支架對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型骨缺損具有更好的修復(fù)作用。Micro-CT顯示復(fù)合支架周圍的骨小梁厚度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨密度、骨小梁數(shù)量均高于殼聚糖支架，硬組織切片可見復(fù)合支架周圍的骨面積比高于殼聚糖支架。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明，含鉭殼聚糖復(fù)合支架不但具有良好的力學(xué)性能，而且還能促進(jìn)支架表面細(xì)