載小分子藥物Purmo rphamine的絲素蛋白超細纖維的成骨誘導(dǎo)性能研究.pdf

1、絲素蛋白（SF）是一種綜合性能優(yōu)良的天然生物材料，通過電紡技術(shù)將SF制備成超細纖維實現(xiàn)對天然細胞外基質(zhì)（ECM）的超微結(jié)構(gòu)仿生是當(dāng)前骨組織工程（BTE）研究領(lǐng)域的熱點之一。電紡SF纖維結(jié)合具有再生特性的干細胞將有利于提高BTE方法修復(fù)骨缺損的再生功效，這需要提高支架的成骨誘導(dǎo)分化性能。Purmorphamine（PM）是一種新型的嘌呤衍生類小分子藥物，具有優(yōu)良的骨生成誘導(dǎo)活性。本論文主要目的是基于電紡SF仿生纖維，探討引入PM后SF基纖

2、維的成骨誘導(dǎo)分化功效。
　　為了檢測SF本身是否具有成骨誘導(dǎo)能力，本研究首先采用Na2CO3脫膠法從蠶繭中提取SF以及全骨髓貼壁法從大鼠體內(nèi)提取骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），并對提取的SF和BMSCs進行分析鑒定，然后配制含不同SF濃度（0.01％、0.05%和0.1%）的培養(yǎng)基并對BMSCs進行培養(yǎng)，體外檢測這些SF溶液對BMSCs生長、增殖和成骨分化的影響。結(jié)果表明：1）蠶繭提取樣品的FTIR光譜圖在1653、1530.5和

3、1212.3 c m-1附近出現(xiàn)較明顯的吸收峰，分別為酰胺Ⅰ，酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ結(jié)構(gòu)，由此可斷定提取物質(zhì)為SF。所提細胞對MSCs標志物CD29,CD44,CD90的陽性表達率分別為97.65%、99.01%和99.52%，對造血干細胞標志物CD45的表達率為0.07%，且該細胞具有三系分化潛能，因此斷定所獲取的細胞為BMSCs;2）0.05%濃度的SF溶液不僅能顯著促進BMSCs粘附、鋪展和增殖，還能夠促進BMSCs堿性磷酸酶（ALP）的

4、表達，誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化。本部分工作說明SF自身具有成骨誘導(dǎo)特性且誘導(dǎo)功效與其作用濃度有關(guān)，SF可作為一種成骨誘導(dǎo)材料用于BTE支架的構(gòu)建。
　　接著，基于天然骨（密質(zhì)骨）骨膠纖維平行排列結(jié)構(gòu)，本研究采用穩(wěn)定射流電紡技術(shù)（SJES）將SF制備成高度取向（含少量聚氧化乙烯PEO）的超細SF纖維，并用甲醇水溶液對取向SF纖維進行結(jié)構(gòu)改性，之后作水浸泡處理以瀝除纖維內(nèi)的PEO成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲醇水溶液處理后，SF/PEO纖維的

5、力學(xué)性能得到明顯提高，但經(jīng)水處理瀝除PEO后，纖維力學(xué)性能有所降低，親水性能則獲得提高。經(jīng)細胞相容性評估，發(fā)現(xiàn)甲醇改性后的纖維不僅具有良好的細胞相容性，還能調(diào)控細胞沿著纖維排列方向生長，并且瀝除PEO的SF取向纖維更有利于細胞的粘附和鋪展。然后，對PEO瀝除后的SF纖維與傳統(tǒng)電紡制備的無紡SF纖維的成骨誘導(dǎo)活性進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：取向纖維雖然具有骨膠纖維的有序結(jié)構(gòu)，能夠促進BMSCs的增殖，但卻不利于BMSCs的ALP表達。SF纖維的無

6、序結(jié)構(gòu)更有利于促進BMSCs的成骨分化。
　　基于以上結(jié)果，本研究接著在無紡SF纖維中引入具優(yōu)良生物相容性和骨傳導(dǎo)與骨誘導(dǎo)活性的羥基磷灰石（HAp）制備HAp/SF復(fù)合纖維，從力學(xué)性能方面評價HAp的最佳添加量，然后評估該體系下HAp/SF復(fù)合纖維的成骨誘導(dǎo)性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）HAp能較好地分散在SF纖維中，并與SF的羧基基團存在一定的化學(xué)鍵相互作用。10%的HAp能夠顯著提高SF納米纖維的楊氏模量5.58倍，力學(xué)性能增強效果最佳

7、，但親水性能有所下降；2）10%HAp的加入不僅能夠提高BMSCs的粘附、鋪展和增殖以及細胞對材料的趨附性，還能夠促進BMSCs的ALP和膠原（COL）蛋白的分泌，提高ALP, COL,骨鈣素（OCN）和骨粘連蛋白（ON）的mRNA表達水平，顯示出優(yōu)良的成骨分化誘導(dǎo)性能。
　　最后，本研究引入PM以進一步增強HAp/SF復(fù)合纖維的成骨誘導(dǎo)分化功效，從蛋白和基因水平檢測PM/HAp/SF復(fù)合纖維的成骨誘導(dǎo)活性并分析其作用機理。為了探

8、索PM誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的最佳濃度，首先配制含不同PM濃度（0.1,3和10μM）的培養(yǎng)基對BMSCs進行培養(yǎng)，并與常用成骨誘導(dǎo)劑體系（地塞米松、抗壞血酸和β-甘油磷酸鈉）的成骨誘導(dǎo)活性進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3μM PM的成骨誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)功效與常用成骨誘導(dǎo)劑相當(dāng)，說明PM可以很好的取代常用成骨誘導(dǎo)劑，用于BTE支架的制備。然后，基于這一最佳濃度，對纖維中引入PM的最佳負載量進行探索，并檢測不同PM濃度對纖維物理性能（如形貌、力學(xué)性

9、能和親水性能等）、PM藥物釋放行為及細胞相容性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）PM的加入雖然有利于細化纖維直徑，但也會略微降低纖維力學(xué)性能和親水性能；2）纖維內(nèi)的HAp組分對PM藥物釋放具有緩釋作用；3）PM的加入有利于促進細胞的粘附、鋪展和增殖。最后，從蛋白和基因水平上評價細胞相容性有顯著性差異的兩個載藥纖維組別（10-PM/HAp/SF和20-PM/HAp/SF）誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的效能，并探索其誘導(dǎo)細胞成骨分化的作用機理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）

10、PM與HAp誘導(dǎo)BMSCs成骨分化效果具有協(xié)同作用，共同促進細胞ALP, C OL, OCN和ON基因的表達；2）10-PM/HAp/SF復(fù)合纖維主要通過激活Hed geho g信號通路來誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。
　　總之，本研究證實了SF自身就具有成骨誘導(dǎo)活性這一本質(zhì)特性，通過S JES制備了取向SF纖維對天然骨（密質(zhì)骨）進行結(jié)構(gòu)仿生，發(fā)現(xiàn)其成骨誘導(dǎo)活性并不如無紡SF纖維。在無紡SF纖維中引入HAp，發(fā)現(xiàn)10% HAp/SF復(fù)

11、合纖維的力學(xué)性能和成骨誘導(dǎo)活性都有顯著的提高。PM誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的最佳作用濃度是3μM，引入PM的PM/HAp/SF復(fù)合纖維可顯著提高對BMSCs的成骨誘導(dǎo)作用功效，且其可能主要是通過激活Hedgehog信號通路誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。所有結(jié)果均表明PM/HAp/SF纖維可顯著誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，具有優(yōu)良的生物相容性和成骨誘導(dǎo)活性，這為今后基于PM/HAp/SF纖維開展對體內(nèi)骨缺損的再生性修復(fù)評價工作奠定了基礎(chǔ)，在BTE領(lǐng)