肽類化合物對(duì)H37Ra抑制的優(yōu)化篩選.pdf

1、長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)碩士論文摘要結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染疾病，現(xiàn)有研究表明結(jié)核桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài)，通過(guò)乙醛酸循環(huán)獲取能量，至今尚未在人等哺乳動(dòng)物中(小鼠除外)發(fā)現(xiàn)此循環(huán)。現(xiàn)有藥物會(huì)隨著患者免疫力下降或者停藥，而重新致病。因此研究新型抗結(jié)核藥物迫在眉睫。異檸檬酸裂解酶(ICL)是結(jié)核桿菌在人體內(nèi)處于持續(xù)感染狀態(tài)時(shí)乙醛酸支路代謝中的關(guān)鍵限速酶，是其潛伏狀態(tài)下生存所必需的。因此，本文以ICL為靶點(diǎn)研發(fā)抗結(jié)核藥物。本研

2、究利用Fmoc固相合成法合成多肽抑制劑，HPLC色譜儀純化合成的多肽并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。通過(guò)H37Ra抑菌實(shí)驗(yàn)，確定不同培養(yǎng)基條件下多肽的抑菌效果，并測(cè)定其最小抑菌濃度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)。加入不同濃度Vc，比較抑菌效果，進(jìn)一步優(yōu)化篩選多肽抑制劑。本研究共篩選得到4條多肽且均有抑菌效果，并與劑量相關(guān)。結(jié)果表明，濃度為800～1500兒g／mL時(shí)，各組多肽均有抑菌作用。濃度為500pg／mL

3、時(shí)，正常培養(yǎng)基中只有一種肽有抑菌作用，而限制碳源培養(yǎng)基中均不能抑菌。篩選出一個(gè)多肽(2號(hào))抑菌效果最好，在正常培養(yǎng)基中MIC為200pg／mL，限制碳源中為500tg／mL。根據(jù)MIC結(jié)果，抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到多肽、利福平和異煙肼的抑菌效果與劑量相關(guān)。篩選2號(hào)肽通過(guò)MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，細(xì)胞選用具有吞噬作用的THP1細(xì)胞。結(jié)果表明，肽濃度增大為20mg／mL時(shí)，MTT檢測(cè)細(xì)胞毒性較小。采用20mg／mL進(jìn)行胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)其生物活

4、性。H37Ra感染THP1，篩選肽對(duì)H37Ra在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力的測(cè)定結(jié)果表明，細(xì)菌已經(jīng)被細(xì)胞有效吞噬。菌落計(jì)數(shù)顯示，H37Ra感染nP1后細(xì)菌可在胞內(nèi)繁殖，且隨感染時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)量增加。當(dāng)肽為20mg／mL時(shí)，4d、7d菌落數(shù)均下降，細(xì)菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。這說(shuō)明在較低的濃度下，2號(hào)肽表現(xiàn)出對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的抑制作用。本研究證明從生物信息學(xué)出發(fā)，通過(guò)篩選肽MIC、肽最小細(xì)胞毒性、篩選肽胞內(nèi)抑菌一系列操作優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定有效的多肽。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探

5、索結(jié)核桿菌抑制劑奠定了良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑MIC細(xì)胞毒性巨噬細(xì)胞長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)碩士論文studyshowedthatthepeptideofNo2couldinhibitthegrowthofH37RaintracellularatalowerconcentrationBasedOnbioinformatics，peptideinhibitorswerescreenedandoptimizatedwhichtarg