明綠豆中PAL、SOD的研究及L-SOD的制備.pdf

1、明光綠豆以其色澤晶瑩碧綠，粒大皮薄、湯清易爛，清香可口等特點(diǎn)，質(zhì)量為全國(guó)之冠，被稱為“明綠”，曾經(jīng)被作為貢品。2008年明光綠豆被列為“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”[1]。我國(guó)對(duì)綠豆的研究長(zhǎng)期以來都主要集中種植上，對(duì)其基礎(chǔ)特性、功能特性、綜合利用及深度開發(fā)缺乏系統(tǒng)深入的研究，采用高新技術(shù)對(duì)原料進(jìn)行深度開發(fā)的成果也尚不多見。
　　本文以明光綠豆為原料，對(duì)其基本成分進(jìn)行了測(cè)定；通過采用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、透析脫鹽、DE-52陰離子交換層析等

2、步驟對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)進(jìn)行分離純化，并對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)和金屬離子及氨基酸等外界因子的影響進(jìn)行初步的探索；利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取明綠豆超氧化物歧化酶(SOD)，通過采用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、透析脫鹽、Sephadex G-75分子篩層析等步驟對(duì)SOD進(jìn)行分離純化并初步探究了SOD的基本酶學(xué)性質(zhì)；同時(shí)，響應(yīng)面優(yōu)化了SOD脂質(zhì)體的制備工藝，并初步研究了脂質(zhì)體包封后SOD的穩(wěn)定性等。為明綠豆的綜合

3、利用以及其功能性成分的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.明綠豆基本成分測(cè)定結(jié)果如下：
　　(1)明綠豆基本成分含量：水分為11.82％，粗淀粉為53.25%，粗蛋白為25.26%，粗脂肪為0.90%，灰分為3.70%；
　　(2)明綠豆中必需氨基酸含量：纈氨酸為22.57 mg/g，蘇氨酸16.63 mg/g，蛋氨酸5.94 mg/g，異亮氨酸18.21 mg/g，亮氨酸38.00 mg/g，

4、苯丙氨酸28.50 mg/g，賴氨酸35.23 mg/g；蘇氨酸為明綠豆的第1限制氨基酸；
　　(3)明綠豆中礦物質(zhì)含量：Ca47.76 mg/kg，Cu0.54 mg/kg，F(xiàn)e1.94 mg/kg，Zn2.09 mg/kg，K576.69 mg/kg，Mn0.79 mg/kg；
　　2.明綠豆PAL最佳分離純化條件為：PAL洗脫液pH值為8.8，最佳離子強(qiáng)度為0.4 mol/L氯化鈉。PAL的純化倍數(shù)為6.9829，蛋白

5、質(zhì)得率為4.65%，酶得率為32.45%。
　　3.明綠豆PAL基本性質(zhì)的研究：
　　(1)PAL在硼砂-硼酸緩沖溶液中適宜的pH范圍為7.6~9.0，最適pH有2個(gè)：8.0和8.6。
　　(2)PAL最適溫度范圍為35～45℃，最適反應(yīng)溫度為40℃。超過70℃則被鈍化。
　　(3)得到PAL的兩個(gè)Km值，分別是：Km1為6.94×10-5 mol/L，Km2為1.23×10-4 mol/L。經(jīng)SDS-PAGE鑒

6、定為兩條蛋白質(zhì)區(qū)帶，其亞基分子量分別為52 KD，57 KD。
　　(4)L-酪氨酸、L-半胱氨酸、組氨酸和肉桂酸對(duì)PAL活性都有抑制作用，抑制程度隨抑制劑不同而不同。L-胱氨酸對(duì)PAL的活性無影響。
　　4.明綠豆SOD最佳提取條件：采用液固比22（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH7、超聲功率140 W、超聲時(shí)間20 min，超聲水浴溫度44℃、水浴浸提時(shí)間1.5 h、水浴浸提溫度60℃的組合，明綠豆SOD的實(shí)際比活力為856

7、.95 U/mg。
　　5.明綠豆SOD的分離純化：SOD的最佳鹽溶條件為35%硫酸銨，最佳鹽析條件為85％硫酸銨；經(jīng)過一系列分離純化，明綠豆SOD的純化倍數(shù)為29.93，蛋白質(zhì)得率為4.65%，酶得率為46.62%。
　　6.明綠豆SOD的基本性質(zhì)：明綠豆SOD對(duì)酸具有一定的穩(wěn)定性，最適pH范圍為6～8；明綠豆SOD具有一定的熱穩(wěn)定性，最適溫度范圍為40～60℃，最適溫度為60℃。
　　7.明綠豆SOD脂質(zhì)體最佳制備

8、工藝參數(shù)：脂膽比2.1（mL/g）、類脂濃度為21 mg/L、有機(jī)相與水相體積比為4.1(mL/mL)。在此最優(yōu)條件下SOD脂質(zhì)體包封率達(dá)88.73%。
　　8.SOD脂質(zhì)體（L-SOD）穩(wěn)定性研究：累積釋放12 h時(shí)，SOD的釋放度為77%；24 h時(shí)，SOD的釋放度為95%。80℃水浴恒溫150 min L-SOD的相對(duì)活力為90%，游離的SOD僅為2%。經(jīng)胃蛋白酶在37℃作用10 min后，游離SOD的活性殘留5.2%，L-