半乳糖基甘油酯的酶法合成及其抑菌活性研究.pdf

1、甘油糖酯廣泛存在于植物、動物組織和微生物中，是植物葉綠體囊膜、細(xì)菌菌膜的重要組成成分，在化妝品、生物醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。甘油糖酯的生物活性中研究較多的主要有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，對抑菌活性的研究較淺。目前合成甘油糖酯的方法主要是酶催化法。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，酶催化合成可以直接對底物進(jìn)行利用，反應(yīng)條件溫和，選擇性較高。本研究主要合成并分離制備出一系列?；滈L的半乳糖基甘油酯，探討了半乳糖基甘油酯的酶

2、催化合成工藝，并對半乳糖基甘油酯的抑菌活性進(jìn)行了研究。主要結(jié)果描述如下:
　　1.半乳糖基甘油酯的分離純化。以實(shí)驗(yàn)室自制的半乳糖基甘油和游離脂肪酸為原料，固定化脂肪酶Novozyme435為催化劑，在丙酮體系中合成了不同?；滈L（C10～C18∶2）的半乳糖基甘油酯。確定了半乳糖基甘油酯的TLC分析條件:半乳糖基甘油癸酸酯和脂酸酯的TLC展開體系為CH2Cl2∶CH3OH(9∶1，v/v)，半乳糖基甘油月桂酸酯、棕櫚酸酯和油酸酯的

3、TLC展開劑為CH2Cl2∶CH3OH(13∶1，v/v)，半乳糖基甘油亞油酸酯的TLC展開劑為CH2Cl2∶CH3OH(10∶1，v/v)。通過硅膠柱層析對半乳糖基甘油酯進(jìn)行分離純化:用氯仿平衡2-3個柱體積后上樣，用含體積比0.5％甲醇和0.05％乙酸的氟仿溶液洗脫過量的脂肪酸;隨后用一定比例的氯仿∶甲醇∶水（下層）洗脫并分管收集，得到半乳糖基甘油單酯及其二酯的純品;最后用甲醇洗脫未反應(yīng)的底物半乳糖基甘油。將分離出的12種半乳糖基甘

4、油酯通過HPLC-ELSD和MS進(jìn)行定性和定量分析，確定了分析不同半乳糖基甘油酯的流動相條件。分析結(jié)果表明，上述半乳糖基甘油酯的純度均達(dá)到97％以上。
　　2.半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成及鑒定。通過單因素實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)溶劑、脂肪酶添加量、底物摩爾比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等影響脂肪酶催化合成半乳糖基甘油棕櫚酸酯的因素進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方法，對三個影響較大的因素（酶添加量、底物摩爾比、反應(yīng)時間）進(jìn)行了優(yōu)化，響應(yīng)值為半乳糖基

5、甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率，得到了最佳反應(yīng)條件:丙酮為溶劑，酶添加量為12.93 mg/mL，底物摩爾比（半乳糖基甘油∶棕櫚酸）為1∶4.49，55℃水浴反應(yīng)27.60 h時，半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)率可達(dá)到90.17％，與模型預(yù)測值基本一致(90.18％)。最后通過NMR對半乳糖基甘油棕櫚酸單酯和二酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到半乳糖基甘油棕櫚酸單酯結(jié)構(gòu)為1-O-棕櫚酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油和3-O-(6'-O-棕櫚?；?β-D-吡喃半乳糖

6、基)-sn-甘油兩種;二酯結(jié)構(gòu)為1-O-棕櫚?；?3-O-(6'-O-棕櫚酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油。
　　3.半乳糖基甘油月桂酸酯的合成及鑒定。對反應(yīng)溶劑、脂肪酶添加量、底物摩爾比、分子篩添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等影響酶催化合成半乳糖基甘油月桂酸酯的因素進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，得到了較為合理的反應(yīng)條件:以丙酮為反應(yīng)溶劑，固定化脂肪酶Novozyme435的添加量為30 mg/mL，底物摩爾比（半乳糖基甘油∶月桂酸）為1

7、∶12，分子篩添加量為58 mg/mL，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時間為24 h，此時半乳糖基甘油月桂酸酯產(chǎn)率為87.06％。之后，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對酶添加量、底物摩爾比和反應(yīng)時間進(jìn)行了響應(yīng)曲面優(yōu)化，響應(yīng)值為半乳糖基甘油月桂酸酯產(chǎn)率，優(yōu)化得到了最佳反應(yīng)條件:當(dāng)酶添加量為24 mg/mL，底物摩爾比（半乳糖基甘油∶月桂酸）為1∶11.8，55℃水浴反應(yīng)25.24 h時，半乳糖基甘油月桂酸酯的產(chǎn)率可達(dá)到89.21％，模型預(yù)測值基本一致(89

8、.68％)，且與單因素優(yōu)化結(jié)果相比產(chǎn)率有所提高。最后通過NMR對半乳糖基甘油月桂酸單酯和二酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到半乳糖基甘油月桂酸單酯結(jié)構(gòu)為1-O-月桂?；?3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油和3-O-(6'-O-月桂?；?β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油兩種;二酯結(jié)構(gòu)為1-O-月桂?；?3-O-(6'-O-月桂?；?β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油。
　　4.半乳糖基甘油酯的抑菌效果研究。將半乳糖基甘油和之前合成的10種半乳糖基

9、甘油酯作用于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母，進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn);采用倍比稀釋法測定10種半乳糖基甘油酯的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明:半乳糖基甘油沒有抗菌活性，半乳糖基甘油酯對食品常見的一些細(xì)菌均有一定的抗菌活性，對酵母和霉菌沒有抗菌活性。?；滈L度對半乳糖基甘油酯的抑菌活性影響較大，以中鏈脂肪酸為酰基供體時半乳糖基甘油酯的抑菌活性高于其他脂肪酸為?；w的半乳糖基甘油酯;?；滈L相同時，添加?；湹牟伙柡投纫志钚杂兴龃?。