利用G-CSF動(dòng)員的PBMC制備的CMV-CTL治療異基因造血干細(xì)胞移植后HCMV感染的臨床研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）為β-皰疹病毒的一種，為雙鏈DNA病毒，具有種屬特異性，其在我國(guó)人群的潛伏感染率達(dá)到90％。HCMV首先感染樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），但感染后病毒并不能被徹底清除，病毒可潛伏在某些特定的CD34+造血祖細(xì)胞內(nèi)，在其向髓系細(xì)胞的分化過(guò)程中，潛伏的病毒也被保存下來(lái)。當(dāng)宿主免疫功能

2、低下時(shí)，潛伏的病毒可發(fā)生再次激活。
　　異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）作為目前治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的方法已被廣泛應(yīng)用，雖然造血干細(xì)胞移植的發(fā)展使血液系統(tǒng)惡性腫瘤的生存率有明顯提高。但移植后相關(guān)并發(fā)癥仍為影響患者預(yù)后的主要因素，由于移植過(guò)程應(yīng)用致死劑量的放化療且移植后免疫抑制劑的應(yīng)用而使患者免疫功能顯著降低，導(dǎo)致移植后感

3、染的發(fā)生率明顯增加，且移植早期發(fā)生感染會(huì)導(dǎo)致較高的致死率。而HCMV作為長(zhǎng)期潛伏在人體內(nèi)的機(jī)會(huì)致病菌，引起巨細(xì)胞病毒感染有很多移植相關(guān)危險(xiǎn)因素。有研究分析得出清髓性預(yù)處理方案，巨細(xì)胞病毒感染前發(fā)生急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，aGVHD）為移植后HCMV初次激活的危險(xiǎn)因素，而原發(fā)病為淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤患者則為移植后連續(xù)HCMV感染的危險(xiǎn)因素。且有研究分析巨細(xì)胞病毒感染到巨細(xì)胞病毒感

4、染性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素，得出最初發(fā)生巨細(xì)胞病毒感染時(shí)CMV拷貝數(shù)高，且監(jiān)測(cè)到CMV拷貝數(shù)時(shí)粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞缺乏為巨細(xì)胞病毒感染發(fā)展為巨細(xì)胞病毒感染性疾病的危險(xiǎn)因素，其中淋巴細(xì)胞缺乏可作為獨(dú)立因素預(yù)測(cè)巨細(xì)胞病毒感染發(fā)展為巨細(xì)胞病毒感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。
　　雖然更昔洛韋及膦甲酸鈉對(duì)控制CMV感染有一定療效，但抗病毒藥物存在明顯的骨髓抑制及腎臟損傷，可以延遲患者CMV特異性免疫的恢復(fù)，造成遲發(fā)型CMV感染的發(fā)生，且遲發(fā)型CMV感染的

5、病死率較高，可達(dá)40%以上。
　　隨著細(xì)胞治療的發(fā)展，抗病毒的細(xì)胞治療成為了研究的熱點(diǎn)，而細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）作為抗病毒細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞成為了研究的焦點(diǎn)。近幾年，各中心探索不同的細(xì)胞制備方法，并進(jìn)行臨床試驗(yàn)取得較好療效。目前制備巨細(xì)胞病毒特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞的方法主要為體外培養(yǎng)，利用四聚體篩選，利用IFN-γ篩選等方法。體外培養(yǎng)法多采用樹突狀細(xì)胞為抗原呈遞細(xì)胞，利用巨細(xì)胞病

6、毒抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞后，利用成熟的樹突狀細(xì)胞去刺激淋巴細(xì)胞獲得病毒特異性 CTL。四聚體篩選技術(shù)，為利用 HLA-多肽四聚體及磁珠分選的方法可從供者體內(nèi)分離針對(duì)CMV的特異 CTL。但四聚體篩選方法需提前明確患者的HLA的表達(dá)，并篩選不同HLA位點(diǎn)識(shí)別的肽段。利用γ-干擾素直接從供者外周血分離CTL的方法為采集CMV血清學(xué)陽(yáng)性供者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞與pp65抗原孵育，標(biāo)記抗干擾素抗體，通過(guò)免疫磁珠分選陽(yáng)性細(xì)胞，獲得CMV

7、特異性CTL。利用IFN-γ篩選雖然無(wú)HLA限制性，但需要大量供者外周血，且實(shí)驗(yàn)成本較高。以上方法均應(yīng)用供者外周血，有研究表明G-CSF動(dòng)員后的外周血單個(gè)核細(xì)胞可抑制T淋巴細(xì)胞增值，并降低其IFN-γ及IL-4的釋放。但隨后有中心驗(yàn)證可以利用G-CSF動(dòng)員后的外周血制備CMV特異性CTL，且與傳統(tǒng)非動(dòng)員PBMC進(jìn)行比較，生物學(xué)特性無(wú)明顯差異[12]。
　　通過(guò)回顧性分析在本中心自2011年12月至2014年12月行異基因造血干細(xì)胞

8、移植患者398例，應(yīng)用Kaplan Meier及Logistics回歸模型，分析了CMV感染的發(fā)生率及其發(fā)生的危險(xiǎn)因素。經(jīng)分析得出，398例患者中233例發(fā)生CMV感染，累計(jì)發(fā)生率為58.5%。單因素分析中，HLA不全相合、預(yù)處理過(guò)程中使用抗人免疫球蛋白（anti-human thymocyte globulig，ATG）、發(fā)生急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)及激素用量≥1

9、mg/kg潑尼松與CMV感染發(fā)生率增加有關(guān)。多因素分析中，HLA不全相合（HR=2.765，p=0.000）、預(yù)處理過(guò)程中使用ATG（HR=3.866，p=0.000）及激素用量≥1mg/kg潑尼松（HR=4.767，p=0.000）使CMV感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。綜上所述，供者與患者HLA不全相合、預(yù)處理過(guò)程中應(yīng)用ATG及治療過(guò)程中激素用量≥1mg/kg潑尼松都會(huì)增加患者CMV感染的發(fā)生率。
　　利用G-CSF動(dòng)員的外周血單個(gè)核細(xì)胞，通

10、過(guò)貼壁法分離樹突狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，并利用覆蓋中國(guó)人群90%以上巨細(xì)胞病毒多肽去負(fù)載樹突狀細(xì)胞并激活淋巴細(xì)胞，制備CMV-CTL。通過(guò)分析細(xì)胞表型、細(xì)胞內(nèi)IFN-γ檢測(cè)及細(xì)胞因子分泌的檢測(cè)來(lái)鑒定制備細(xì)胞的生物學(xué)特性。經(jīng)分析得出，經(jīng)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，CD3細(xì)胞比例明顯增高，經(jīng)抗原刺激后制備細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)IFN-γ分泌增高；細(xì)胞因子測(cè)定為IFN-γ、TNF-α及顆粒酶分泌相比陰性對(duì)照組明顯增高。綜上所述，經(jīng)該體系制備的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有

11、特異性細(xì)胞殺傷活性。
　　自2015年4月至2016年3月，共6例患者在本中心入組臨床試驗(yàn)，應(yīng)用CMV特異性CTL治療造血干細(xì)胞移植后CMV感染。利用上述方法制備的CMV特異性CTL治療移植后CMV感染，輸注細(xì)胞數(shù)為1×107/m2/次，輸注周期為每周一次，直至CMV轉(zhuǎn)陰或連續(xù)輸注四次仍無(wú)效則停止輸注。CMV的監(jiān)測(cè)采用Q-PCR法，每周兩次。經(jīng)分析得出，患者通過(guò)輸注CMV特異性CTL無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生，可以有效控制患者CMV感染。