飼料中伏馬菌素B1電化學(xué)生物傳感器檢測方法建立與應(yīng)用.pdf

1、霉菌毒素(Mycotoxins)是由各種霉菌產(chǎn)生的一系列有毒次級代謝產(chǎn)物。在不同的霉菌毒素中，伏馬菌素是世界上玉米種植區(qū)最常見的霉菌毒素，由于其與人類和家畜疾病有關(guān)，因此玉米谷物中伏馬菌素污染被認(rèn)為是一個(gè)嚴(yán)峻的問題。伏馬菌素包括伏馬菌素B1、B2和B3，是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的，主要自然產(chǎn)生于串珠鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和多育鐮刀菌。伏馬菌素可導(dǎo)致馬的腦白質(zhì)軟化癥，這是在馬中發(fā)生的一種嚴(yán)重甚至死亡的疾病，也可引起豬的致命疾病-豬的肺水腫綜合癥。伏

2、馬菌素已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為人類可能的致癌物。
　　近年來，霉菌毒素的檢測技術(shù)不斷發(fā)展，常見的檢測技術(shù)有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。其中高效液相色譜具有較高的靈敏度和可靠性，是當(dāng)前使用最多的方法。但HPLC需要對樣品進(jìn)行提取凈化，操作較為復(fù)雜，且檢測周期較長。
　　電化學(xué)生物傳感器將生物分析方法與電化學(xué)傳感器技術(shù)結(jié)合，

3、既具有高選擇性又兼有高靈敏性，在生物工程、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥工業(yè)、食品安全和農(nóng)業(yè)分析等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。納米材料具有諸多優(yōu)良特點(diǎn)，如比表面積大、催化活性高、親和力強(qiáng)、具有優(yōu)秀的生物相容性等，已廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的制備。近年來，具有微型化、特異性強(qiáng)、靈敏度高的電化學(xué)生物傳感器技術(shù)成為霉菌毒素檢測的發(fā)展趨勢。
　　本試驗(yàn)將飼料中的伏馬菌素B1(FB1)作為研究對象，通過完全抗原的制備，以單克隆抗體技術(shù)為支撐，分別采用間接競爭和

4、直接競爭的檢測原理，以硫堇作為信號探針，對構(gòu)建伏馬菌素B1的電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行了探索。
　　試驗(yàn)Ⅰ基于納米磁珠和石墨烯信號放大的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建
　　為了制備FB1的單克隆抗體并測定其效價(jià)，本試驗(yàn)采用戊二醛法將FB1與卵清蛋白(OVA)載體蛋白偶聯(lián)，制備FB1完全抗原FB1-OVA。偶聯(lián)后的FB1-OVA通過考馬斯亮藍(lán)試劑盒檢測蛋白質(zhì)含量為1 mg/mL。通過SDS-PAGE鑒定FB1-OVA偶聯(lián)成功，將其作為ELI

5、SA檢測抗體效價(jià)的包被抗原。采用腹水制備技術(shù)制備腹水型FB1單克隆抗體。首先，復(fù)蘇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，測定細(xì)胞上清抗體效價(jià)及其穩(wěn)定性。復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞形態(tài)良好，其上清抗體效價(jià)為1∶1600，分泌抗體穩(wěn)定性良好。其次，選取20只BALB/c雌性小鼠，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞懸液。試驗(yàn)期間，每天觀察小鼠生長情況，待小鼠腹部膨大時(shí)，收集腹水。利用HiTrap Protein G HP蛋白純化柱純化腹水獲得FB1的單克隆抗體，通過蛋白質(zhì)含量

6、測定，F(xiàn)B1單克隆抗體的濃度為10 mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，F(xiàn)B1單克隆抗體分子量為149.50 kDa，且抗體純度較高。通過ELISA測定，F(xiàn)B1腹水單克隆抗體的效價(jià)為1∶102400，可用于構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。
　　采用硫堇作為電活性探針，構(gòu)建了一種新的以Fe3O4磁珠作為信號分子載體的電化學(xué)免疫傳感器用于檢測FB1。首先，利用硫堇與石墨烯制備石墨烯硫堇復(fù)合物，通過紫外分光光度計(jì)表征石墨烯硫堇復(fù)合物合成成功。然后

7、，將連有氨基的Fe3O4磁珠與羊抗鼠二抗通過戊二醛偶聯(lián)，獲得Fe3O4磁珠/Ab2偶聯(lián)物。用EDC和NHS激活石墨烯硫堇復(fù)合物的羧基，與Fe3O4磁珠/Ab2偶聯(lián)物氨基連接，成為該電化學(xué)免疫傳感器的信號分子。本試驗(yàn)中采用金電極作為工作電極，將金電極浸入半胱氨酸進(jìn)行自組裝，通過戊二醛作為連接臂，修飾FB1-BSA偶聯(lián)物，用3％BSA溶液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。樣品溶液中的FB1與電極表面固定的FB1-BSA偶聯(lián)物競爭結(jié)合Ab1，信號分子與A

8、b1連接。通過循環(huán)伏安法檢測電極表面硫堇的電流響應(yīng)值對FB1進(jìn)行定量。本試驗(yàn)中，通過交流阻抗法對電極修飾過程進(jìn)行電化學(xué)表征，結(jié)果顯示電極表面進(jìn)行了層層組裝，對電子傳遞的阻礙逐漸增加。優(yōu)化了電化學(xué)免疫傳感器的檢測條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FB1-BSA包被抗原的最佳濃度為100μg/mL，Ab1的最佳稀釋比例為1∶7000，Ab2的最佳稀釋比例為1∶10000，循環(huán)伏安法檢測溶液最佳pH為7.0，F(xiàn)B1與FB1-BSA競爭結(jié)合Ab1的最佳孵育時(shí)間為4

9、0 min，反應(yīng)溫度為37℃。在最佳試驗(yàn)條件下，該免疫傳感器的線性范圍從10-8 mg/mL到10-4 mg/mL，線性方程為I（μA）=55.7-66.2×lgCFB1(mg/mL)，相關(guān)系數(shù)為-0.9989，檢測限為0.01 ng/mL。結(jié)果表明該傳感器具有良好的重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性。
　　試驗(yàn)Ⅱ基于金納米顆粒和石墨烯硫堇復(fù)合物雙重信號放大電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建
　　本試驗(yàn)中，構(gòu)建了一種基于金納米顆粒和石墨烯

10、硫堇復(fù)合物(GS-TH)雙重信號放大的電化學(xué)適配體傳感器用于檢測FB1。首先，通過改進(jìn)的氯金酸還原法制備了金納米顆粒，通過透射電子顯微鏡表征，制備的金納米顆粒直徑為13nm。本試驗(yàn)中采用的工作電極為玻碳電極，將金納米顆粒滴至電極表面干燥后，修飾捕獲DNA，捕獲DNA與適配體DNA特異性結(jié)合，將修飾電極浸入石墨烯硫堇溶液中自組裝。通過循環(huán)伏安法檢測探針硫堇的電化學(xué)信號。樣品溶液中的FB1與適配體DNA發(fā)生特異性結(jié)合，使得石墨烯硫堇復(fù)合物從

11、電極表面脫落，電化學(xué)信號降低。通過循環(huán)伏安法檢測電極表面硫堇的減少量對FB1進(jìn)行定量。優(yōu)化了電化學(xué)適配體傳感器的檢測條件，捕獲DNA的最佳反應(yīng)濃度為0.25μM，石墨烯硫堇復(fù)合物固定的最佳時(shí)間為3h。在優(yōu)化條件下，建立該電化學(xué)適配體傳感器用于檢測FB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中FB1濃度的線性范圍為10-12至10-4 mg/mL，線性方程為△I(μA)=1.175+0.067×lgCFB1(mg/mL)，相關(guān)系數(shù)為0.9982，F(xiàn)B1的檢測限為

12、1 pg/mL。結(jié)果表明該傳感器具有良好的重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性。
　　試驗(yàn)Ⅲ電化學(xué)適配體傳感器與高效液相色譜法的比較
　　在試驗(yàn)Ⅱ中已建立的電化學(xué)適配體傳感器標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品的加標(biāo)檢測，F(xiàn)B1的最低檢測限為1μg/kg。測定玉米、小麥和全價(jià)飼料樣品中FB1的回收率，添加FB1濃度分別為5μg/kg、50μg/kg和100μg/kg，結(jié)果顯示，三種飼料的回收率均高于90.0％，變異系數(shù)均小于10.0％。
　　

13、本試驗(yàn)建立FB1高效液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)B1的檢測范圍為10～1000 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9998。通過樣品的加標(biāo)檢測，F(xiàn)B1的最低檢測限為10μg/kg。測定玉米、小麥和全價(jià)飼料樣品中FB1的回收率，添加FB1濃度分別為50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg，三種飼料的回收率均高于80.0％，變異系數(shù)均小于10.0％。
　　收集來自全國各地飼料送檢樣品62份，主要包括玉米、小麥、全價(jià)飼料等其他飼料。

14、經(jīng)過提取、凈化后，分別采用電化學(xué)適配體傳感器和HPLC檢測樣品中FB1的含量。結(jié)果顯示，62份飼料樣品，兩種檢測方法的檢出率均為100％。采用電化學(xué)適配體傳感器檢測全部飼料樣品中FB1平均含量為833.3μg/kg，高于HPLC檢測值791.4μg/kg。比較適配體傳感器和HPLC兩種檢測方法的相關(guān)性，將檢出FB1飼料的HPLC檢測結(jié)果作為橫坐標(biāo)，同一樣品的適配體傳感器結(jié)果作為縱坐標(biāo)，建立相關(guān)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9999，結(jié)果表明，適配