磁性酚類仿生粘附復合材料的制備及固定化脂肪酶研究.pdf

1、脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）作為一種重要的生物催化劑，可以催化酯化反應、酯交換反應、水解反應等多種化學反應，對手性底物的選擇性識別具有重要作用。生物催化劑固定化技術(shù)可以改善自由酶催化劑的許多缺點（如穩(wěn)定性差、易失活、不可重復利用且成本較高等），提高酶的穩(wěn)定性，減少對產(chǎn)品的污染，實現(xiàn)酶的回收和重復使用，達到連續(xù)化操作、降低生產(chǎn)成本的目的。本論文依據(jù)上述目標，綜述了固定化酶技術(shù)的發(fā)展及研究現(xiàn)狀，利用鄰苯二酚類衍生物所具備的仿生

2、粘附特性，設計和制備了多種磁性酚類高分子復合材料，構(gòu)建了高效、回收簡便的固定化酶系統(tǒng)。主要研究內(nèi)容總結(jié)如下：
　?。?）聚多巴胺改性的磁性納米石墨片復合材料的制備及其固定化脂肪酶的研究
　　利用多巴胺的粘附特性將其聚合在溶劑熱法制備的Fe3O4@石墨片上，合成了聚多巴胺改性的磁性納米石墨片復合材料。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、紅外光譜、拉曼光譜、振動樣品磁強計（VSM）等對所合成材料進行了表征。由

3、于聚多巴胺的醌式結(jié)構(gòu)可以和酶的氨基發(fā)生席夫堿反應，因而所得復合材料可直接用于共價固定化假絲酵母脂肪酶（CRL），避免了使用其它化學連接劑對酶蛋白造成的破壞。對制備固定化酶的條件進行了優(yōu)化，并研究了固定化酶的各項性質(zhì)。實驗結(jié)果表明，由于結(jié)合了Fe3O4@石墨片優(yōu)異的化學穩(wěn)定性、高負載容量和聚多巴胺良好的生物相容性、易于功能化的特點，聚多巴胺改性的磁性納米石墨片作為載體固定化酶可獲得高酶負載量；與自由酶相比，該固定化酶具有更好的穩(wěn)定性、pH

4、及溫度耐受性，同時也具有較好的重復使用性。
　?。?）聚乙二醇改性的磁性聚多巴胺納米微球的制備及其固定化脂肪酶的研究
　　以氧化聚乙二醇對聚多巴胺包裹的磁性納米微球進行表面改性獲得具有刷狀結(jié)構(gòu)的磁性聚多巴胺載體材料。首先采用浸涂法合成了單分散性的磁性聚多巴胺納米微球，然后采用氧化聚乙二醇對磁性聚多巴胺微球功能化，制備帶有醛基功能基的磁性聚多巴胺微球載體。表征顯示改性后的載體材料呈單分散結(jié)構(gòu)，磁飽和強度達到55.35 emu

5、g-1。分別將醛基功能化和未功能化的磁性聚多巴胺微球用于共價固定化 CRL，優(yōu)化了固定化酶的條件。通過對兩種固定化酶性質(zhì)的測試發(fā)現(xiàn)，具有柔性鏈的醛基功能化的磁性聚多巴胺微球固定化酶的活力回收值更高，同時具有更加優(yōu)異的穩(wěn)定性和催化活力。這說明在具備聚多巴胺的多功能性和氧化聚乙二醇柔性鏈獨特的生物特性和諧調(diào)性之后，所得的柔性功能化載體更有利于穩(wěn)定目標酶的構(gòu)象，能夠有效減少剛性載體固定化酶對酶結(jié)構(gòu)的破壞。
　?。?）氧化海藻酸鈉改性的磁

6、性聚多巴胺復合微球的制備及其固定化脂肪酶的研究
　　通過共價組裝的方法將仿生聚合物（聚多巴胺）和氧化多糖（氧化海藻酸鈉）組裝在超順磁性Fe3O4微球上。在合成了聚多巴胺改性的Fe3O4納米微球的基礎(chǔ)上，將氧化海藻酸鈉結(jié)合到磁性聚多巴胺微球上，用作共價固定化酶的天然高分子連接劑。對所合成材料采用透射電子顯微鏡（TEM）、紅外光譜、X-射線衍射（XRD）、熱失重分析和振動樣品磁強計（VSM）等進行表征，證明所得復合材料為核殼結(jié)構(gòu)，形貌

7、均一，且具有較高的磁飽和強度（57.62 emu g-1）。將氧化海藻酸鈉改性的磁性聚多巴胺微球用作共價固定化 CRL，優(yōu)化固定化酶條件，研究固定化酶的性質(zhì)，結(jié)果表明，該生物粘附型復合材料固定化酶相對于游離酶具有更好的穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性。
　?。?）硬模板法合成磁性聚多巴胺雜化微囊及其固定化脂肪酶的研究
　　以碳酸鈣微球為硬模板合成了結(jié)構(gòu)強韌的有機-無機磁性雜化微囊固定化酶。首先采用共沉淀法制備球霰型碳酸鈣微球，同時將CRL

8、均勻包埋于碳酸鈣微球內(nèi)部。然后利用合成的碳酸鈣微球表面孔徑較大（20-60 nm）、在 pH=7條件下ξ電勢大于零的特點，在其外表面及孔道內(nèi)通過物理吸附和靜電相互作用吸附荷負電的Fe3O4納米顆粒（粒徑＜20 nm，經(jīng)檸檬酸改性）。然后在該磁性碳酸鈣微球表面進行多巴胺的原位聚合，以獲得磁性聚多巴胺-碳酸鈣微球。最后，利用 EDTA去除碳酸鈣即可獲得有機-無機磁性雜化微囊固定化酶。通過一系列表征方法對微囊強韌的中空結(jié)構(gòu)進行了表征，并對內(nèi)部

9、包裹的CRL具有的自由狀態(tài)進行了佐證。在該聚合物微囊中引入磁性Fe3O4納米顆粒具有雙重的重要意義：既為固定化酶的回收和重復利用提供了便利又為微囊提供了剛性支架，避免聚合物微囊的塌陷、褶皺。通過對固定化酶的性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)該微囊固定化酶具有諸多優(yōu)勢：較高的酶包裹率，酶催化反應活力和貯存穩(wěn)定性，同時也表現(xiàn)出優(yōu)良的動力學行為和重復使用性。
　?。?）多酚-金屬絡合物構(gòu)筑的磁性殼聚糖雜化微囊及其固定化脂肪酶的研究
　　通過在Fe

10、3O4/殼聚糖聚集體表面包裹單寧酸-鐵離子交聯(lián)膜制備了金屬-多酚膜加固的Fe3O4/殼聚糖雜化微囊。首先，通過離子交換作用將檸檬酸改性的Fe3O4納米顆粒吸附在包裹有CRL的殼聚糖-檸檬酸鈉微聚集體表面。持續(xù)攪拌一段時間后，由于外部 Fe3O4的吸附作用導致聚集體內(nèi)部電荷分布不勻，使得殼聚糖-檸檬酸鈉微聚集體內(nèi)部的檸檬酸鈉被釋放到溶液中，引起了殼聚糖-檸檬酸鈉聚集體的解組裝，從而形成微囊。為了得到一個更加完整、強健的囊結(jié)構(gòu)，將金屬-多酚

11、（單寧酸-鐵離子）交聯(lián)膜被包裹在Fe3O4/殼聚糖雜化微囊表面以形成粘附層。在制備殼聚糖-檸檬酸鈉聚集體的同時將CRL包埋于聚集體內(nèi)部。整個制備微囊固定化酶過程反應條件溫和、高效，可在40 min之內(nèi)完成。分別制備了未包裹和包裹了金屬-多酚交聯(lián)膜的兩種 Fe3O4/殼聚糖微囊固定化酶，研究固定化酶的性質(zhì)，結(jié)果表明單寧酸-鐵離子加固的Fe3O4/殼聚糖微囊固定化酶在酶活力、穩(wěn)定性、動力學以及重復使用性方面較未經(jīng)包裹的固定化酶均具有更優(yōu)異的