促紅細胞生成素對心肌梗死后小鼠心臟結構和功能的影響.pdf

1、背景：
　　心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）是一類由于心肌長時間缺血缺氧，最終導致心肌損傷甚至壞死的一類疾病。到2020年，全球心血管病的死亡率將增加50％，其中MI將位于死因榜的首位，MI已給全球醫(yī)療帶來了沉重的負擔。
　　隨著各種醫(yī)療技術的應用，目前MI急性期的死亡率已明顯下降。但是MI后，大量缺血壞死心臟細胞會被纖維組織所取代形成瘢痕，直接影響心臟的舒縮功能，最終導致心力衰竭的發(fā)生。目前藥物

2、治療、介入治療以及外科冠狀動脈旁路搭橋術也只能恢復局部心肌血液供應，延緩不利的心肌重塑，而不能從根本上解決心肌梗死后心肌數(shù)目減少、心功能進行性下降這一根本問題。因此，針對性防治各類心肌細胞死亡或促進心肌細胞再生，一直是MI治療領域的熱點問題。
　　促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是由腎臟分泌的一類糖蛋白類激素，臨床上已經(jīng)將它廣泛用于貧血的治療，現(xiàn)在已逐步發(fā)現(xiàn)它在心血管系統(tǒng)的獨特作用：它具有抗凋亡、抗炎、抗氧化

3、、促干細胞遷移、增殖、分化和促進血管生成的作用，因此，我們推測：EPO在一定程度上可能對于損傷心肌具有保護作用。但有研究表明，其全身用藥會帶來許多副作用，如：發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、氣喘和上呼吸道感染，甚至會出現(xiàn)高血壓、癲癇和血栓等。因此，如何選擇EPO的給藥方式至關重要。
　　綜上所述，為深入觀察 EPO對梗死后心臟的治療作用，我們建立了小鼠心肌梗死模型，并于術后3天給予EPO心肌注射治療，隨后動態(tài)檢測了術后1周、2周、4周的心臟結構

4、和功能的變化情況及心肌細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律。通過以上研究，以期發(fā)現(xiàn)EPO對MI的療效，為臨床治療MI提供新的思路和方法。
　　目的：
　　(1)建立成年小鼠心肌細胞分離的有效方法；
　　(2)觀察EPO對心梗后心臟結構和功能，以及心肌細胞凋亡的動態(tài)影響。
　　方法：
　　(1)改良成年小鼠心室肌細胞(Adult Mouse Ventricular Cardiomyoctyes, AVCMS)分離方法。使用

5、本實驗獨創(chuàng)的手術方法，給未成年雄性C57小鼠心臟行在體冠脈逆行插管，經(jīng)Langendorff灌流沖洗干凈心臟，膠原酶液充分酶解消化心臟，將其撕碎并吹打成細胞懸浮液后，置于細胞培養(yǎng)液中進行后續(xù)實驗。與經(jīng)典離體插管分離方法對比了插管時間，細胞成活率和細胞收獲量。
　　(2)新式小鼠 AMI模型建造方法。麻醉小鼠后，仰臥位固定，于左胸前壁剪一微型斜切口，鈍性分離肌肉，將心臟擠壓至胸腔外，結扎冠狀動脈左主降支，見心尖處變灰白后，迅速將心臟

6、復位，擠出胸腔中的氣體，荷包縫合術閉合肌肉和皮膚。偽手術組是在冠狀動脈下方穿過手術線而不結扎。
　　(3)心肌內注射EPO或PBS。確定建模成功的小鼠，MI術后三天，再次打開胸腔，暴露心臟，在心臟缺血區(qū)的邊緣3點注射20 ul EPO或PBS。實驗小鼠分為五組：偽手術組、sham+EPO組、sham+PBS組、MI+EPO組和MI+PBS組，分別于手術后7天、14天、28天，用天平稱重法、TTC染色、Masson染色和小動物超聲觀

7、察心臟的重量、心梗面積、心肌纖維化程度和心功能的動態(tài)變化。
　　(4)觀察 EPO對心肌細胞凋亡的影響。MI手術后7天取心室肌組織制備石蠟切片，通過TUNEL染色來對比兩組心肌細胞凋亡的動態(tài)變化。
　　結果：
　　(1)AVCMS的分離：急性分離小鼠心室肌細胞，呈長桿狀，條紋清晰，快速在體主動脈插管基礎上，每只小鼠可以獲得6.1±0.27×106個AVCMS，且培養(yǎng)24h后細胞的成活率為58.4±10.92%。

8、　　(2)EPO對心梗后心臟結構和功能的影響：MI+EPO組較對照MI+PBS組，在術后1、2、4周，小鼠存活率高，心梗面積明顯縮??；心肌纖維化程度較低，且心臟功能均優(yōu)于對照組。
　　(3)EPO對心梗心肌細胞凋亡的動態(tài)影響：在MI術后1周，通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，EPO能顯著降低細胞的凋亡率。
　　結論：
　　(1)在體分離成年小鼠心室肌細胞法較離體法，用時較短、細胞收獲量更多、細胞存活率更高。
　　(2)EP