基于核酸適配體構象變化的抗生素電化學傳感器研究.pdf

1、抗生素作為一種微生物的代謝產(chǎn)物，具有殺死或抑制微生物生長的作用。近年來作為抗菌藥物被廣泛應用于治療各種非病毒感染疾病，尤其是在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中的應用越來越廣泛。抗生素的過量和不正當使用導致了它在食物中的殘留量逐年增加。人們長期食用含有抗生素殘留的食物會導致體內抗生素的富集，使人體對抗生素產(chǎn)生抗藥性，同時也誘導產(chǎn)生了超級細菌。近年來食物中抗生素殘留問題受到世界各國的極大關注，很多國家也制定了一系列有關食物中抗生素的最大殘留量指標。但是現(xiàn)存檢

2、測抗生素的傳統(tǒng)方法均受到各種內在外在條件的限制。因此，迫切需要研究一種高靈敏性、高選擇性的檢測食物中抗生素殘留量的方法。本文利用電化學傳感手段結合核酸適配體的構象變化構建了檢測食品中抗生素殘留量的生物傳感器。構建的傳感器對待測目標物均表現(xiàn)出較低的檢測限和較寬的線性范圍，并有良好的選擇性和穩(wěn)定性，在實際樣品的檢測中也得到了較好的回收率。
　　本論文主要進行了以下幾方面研究：
　　1.通過在修飾了納米金/石墨烯-殼聚糖復合物的玻

3、碳電極上自組裝巰基化的孔雀石綠適配體來構建一個基于電化學傳感體系的RNA適體傳感器來靈敏、特異得檢測孔雀石綠的電化學傳感器。電極構建完成后，先將烷硫醇固定在納米金表面來形成統(tǒng)一的修飾，并減少非特異性吸附。然后將修飾好的電極在含有孔雀石綠的體系中孵育，目標物孔雀石綠可以誘導其適配體發(fā)生構象變化，并特異性的結合孔雀石綠，從而將目標分子固定在電極表面。然后再將標記有辣根過氧化物酶的孔雀石綠抗體修飾到電極上，由于抗原抗體之間的特異性識別作用，將

4、辣根過氧化物酶固定在電極表面。最后通過讀取辣根過氧化物酶催化的過氧化氫的電還原信號來實現(xiàn)孔雀石綠的定量檢測。結果顯示，構建的傳感器對孔雀石綠具有較低的檢測限：16.3 pg mL-1和寬的線性范圍：1×10-4-10μg mL-1。因此，基于RNA適配體構建的電化學檢測策略能夠簡單、快速、便宜、高靈敏和高特異性的定量檢測孔雀石綠。
　　2.在這項工作中，基于目標物與適配體雜交誘導的二次循環(huán)放大技術，構建了一種用于超靈敏和高選擇性的

5、檢測抗生素的簡單、快速、低成本的電化學生物傳感器。巧妙設計的發(fā)夾探針由目標抗生素的適配體、內切酶識別序列和互補雜交序列組成。有檢測目標物存在時，目標物會與發(fā)夾探針上的適配體雜交，誘導發(fā)夾構象發(fā)生變化，暴露出來的單鏈末端會捕獲均相中游離的信標探針，以固定的信標探針為引物，發(fā)生鏈延伸反應，生成完全互補的雙鏈結構并把目標物游離出來，循環(huán)利用。生成的雙鏈中含有內切酶的識別序列，在內切酶與聚合酶的共同作用下，會產(chǎn)生成百上千的單鏈。產(chǎn)生的單鏈可以消

6、耗溶液中的信標探針導致電化學信號降低，從而實現(xiàn)目標物的定量檢測。據(jù)我們所知，這項工作是第一次將基于目標物與適配體雜交誘導的二次循環(huán)放大技術用于電化學分析檢測抗生素。在最佳條件下，所構建的生物傳感器具有超寬的檢測范圍5 pM-10 nM和極低的檢測限1.09 pM。此外，本研究的生物傳感器也顯示對目標物氨芐青霉素具有高選擇性，并具有檢測速度快、成本低，操作簡單等優(yōu)點。因此，基于目標物與適配體雜交誘導的二次循環(huán)放大技術用于檢測氨芐青霉素的電

7、化學方法具有用于實際中相關食品安全分析和臨床診斷的潛力。
　　3.基于多重循環(huán)放大技術構建了一種超靈敏檢測抗生素的電化學DNA傳感器。該多重循環(huán)放大包括聚合酶輔助的目標物循環(huán)放大和核酸外切酶輔助的二級目標物循環(huán)放大。在實驗過程中，巧妙設計的發(fā)夾探針會被目標物與適配體之間的特異性雜交打開，并引發(fā)聚合酶誘導的目標物循環(huán)放大反應，產(chǎn)生成千上萬的二級目標物。值得注意的是，產(chǎn)生的二級目標物不僅能夠與剩下的發(fā)夾探針發(fā)生反應，也能置換下電極上的