鋅轉(zhuǎn)運體ZnTs在小鼠內(nèi)分泌細胞中的表達及ZnT8參與睪酮合成的分子機制.pdf

1、前言:
　　 鋅是哺乳動物中含量第二豐富的微量元素，參與許多生物學(xué)功能，包括:生長，發(fā)育，生殖，免疫等。鋅在人和動物的新陳代謝中發(fā)揮重要作用，從生化學(xué)角度，鋅參與調(diào)控300多種酶，這些酶參與中間代謝，DNA和RNA合成，基因表達和免疫活性;從激素的穩(wěn)態(tài)角度，鋅也具有重要作用，鋅和幾乎所有的激素可以相互作用。密切相關(guān)的有:甲狀腺素，甲狀旁腺激素，胰島素，垂體激素，雄激素和雌激素等。鋅離子在胰島β細胞中高表達，并且在胰島素分泌小泡中

2、參與胰島素結(jié)晶，也參與垂體中催乳素和腎上腺皮質(zhì)激素的分泌。鋅缺乏使血清中甲狀腺素T3水平下降，同時抑制雄性激素和雌激素的合成與分泌。大量的研究表明，鋅同男性生殖的健康和疾病也有著密切的關(guān)系。睪酮的合成需要多種與鋅有關(guān)的酶的參與才能完成，在睪丸Leydig細胞中，睪酮是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化作用轉(zhuǎn)化而成的，細胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)，3羥甾脫氫酶(3βHSD)，細胞色素P45017α-羥化酶(P450α17)和17

3、β-羥甾脫氫酶(17ββHSD)這4種酶是睪酮生成的基本酶。因而鋅缺乏可使睪酮合成減少，并且缺鋅對睪丸有特殊損害作用，鋅缺乏狀態(tài)下，實驗動物間質(zhì)細胞壞死，數(shù)量減少，影響Leydig細胞產(chǎn)生和分泌睪酮。缺鋅還可導(dǎo)致DNA、RNA聚合酶活性降低，DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成障礙，使細胞增殖受阻，膽固醇催化酶活性降低，也影響促性腺激素的分泌，睪酮及其運輸載體蛋白的合成，最終導(dǎo)致睪酮合成障礙。
　　 鋅離子不能通過被動擴散跨越生物膜，在哺

4、乳動物中由鋅轉(zhuǎn)運體(ZnTsand Zips)來調(diào)節(jié)鋅離子的跨膜運動，鋅轉(zhuǎn)運體ZnT家族是一組具有六個跨膜區(qū)域并富含組氨酸的結(jié)構(gòu)和功能相近的蛋白質(zhì)，其主要功能是促進細胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子轉(zhuǎn)運到細胞膜外或者轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)細胞器中，從而達到降低胞內(nèi)鋅離子的作用。ZnT家族包含10個家族成員，即ZnT1-10，它們與鋅離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。ZnT家族的表達與分布具有組織特異性。近年研究表明，ZnT8主要定位于胰島β細胞的分泌囊泡膜上，由369個氨基酸組

5、成，是胰島的特異性鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白。其功能是特異性的向分泌囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運鋅離子，使鋅離子在囊泡內(nèi)聚集，調(diào)節(jié)胰島素的合成、儲存和分泌。近期研究表明，ZnT8也表達在胰島α細胞和其他內(nèi)分泌細胞，包括甲狀腺濾泡上皮細胞和腎上腺皮質(zhì)細胞。ZnT8與內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，這提示其他ZnTs是否也與內(nèi)分泌細胞密切相關(guān)。同時，鋅轉(zhuǎn)運蛋白1、3、7、8在男性生殖系統(tǒng)均有表達。此前的研究中證實小鼠睪丸中ZnT7表達廣泛，并且ZNT7和鋅離子分布在曲細精管內(nèi)

6、不同種類的細胞中。此前，研究中證實ZnT7將細胞質(zhì)內(nèi)鋅離子轉(zhuǎn)運進高爾基體，并可能參與了高爾基體對蛋白質(zhì)的修飾加工。這也提示與內(nèi)分泌密切相關(guān)的ZnT8是否與雄激素睪酮的合成和分泌具有相關(guān)性。
　　 睪丸間質(zhì)細胞合成的睪酮是確保精子生成、維持正常性欲和雄性第二性征所必需的類固醇激素。大部分睪酮由睪丸的間質(zhì)細胞產(chǎn)生，睪丸中的睪酮水平是血清中的睪酮水平的10倍。LH/hCG是調(diào)節(jié)睪酮生物合成的主要激素， LH/hCG調(diào)節(jié)睪酮合成包括快速

7、和慢性兩種作用方式。LH/hCG刺激LH受體30-60分鐘后，導(dǎo)致cAMP的水平快速和慢性上升，隨后PKA被激活，激活的PKA信號誘導(dǎo)EGFP非依賴性配體所導(dǎo)致的MAPK信號通路的激活。MAPK的激活導(dǎo)致現(xiàn)有的少量StAR磷酸化和轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜，引起類固醇的生成增多。但是LH/hCG調(diào)節(jié)睪酮合成的快速作用機制目前還不是很清楚。在慢性調(diào)節(jié)期，間質(zhì)細胞需要LH/hCG保持其完全分化的結(jié)構(gòu)和功能，2小時之后，慢速PKA信號導(dǎo)致StAR的mR

8、NA轉(zhuǎn)錄水平升高，隨后StAR蛋白表達增高，MAPK的顯著信號不再引起StAR磷酸化和轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜。StAR蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory Protein，類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白)是調(diào)節(jié)這一步驟的關(guān)鍵性因子。文獻證實，幼年及成年小鼠或者大鼠注射生理劑量的LH/hCG后，可誘發(fā)血清睪酮濃度上升。體外原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細胞，給予LH/hCG刺激后，可分泌睪酮，并在一定范圍內(nèi)，分泌睪酮量與LH/hCG的

9、濃度呈正相關(guān)。
　　 綜上所述，鋅在內(nèi)分泌細胞中豐富表達，為深入探討鋅在內(nèi)分泌細胞中鋅穩(wěn)態(tài)的內(nèi)在機制和ZnTs在內(nèi)分泌細胞中的表達與分布，并驗證鋅和ZnTs與相關(guān)激素的合成和分泌的相關(guān)作用。本研究以CD1小鼠為實驗對象，檢測鋅和ZnT1-10在小鼠垂體、腎上腺、甲狀腺、胰腺、睪丸和卵巢中的表達和分布;同時本實驗旨在探討ZnT8介導(dǎo)的鋅離子轉(zhuǎn)運參與hCG誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細胞的睪酮生成的影響及其機制，并進一步驗證ZnT8介導(dǎo)睪酮的

10、生成是通過快速通路還是慢性通路，以及鋅及ZnT8影響睪酮合成時所作用的相關(guān)酶，從而揭示ZnT8參與類固醇激素合成過程中的證據(jù)及機制。
　　 實驗方法:
　　 1、鋅和鋅轉(zhuǎn)運體ZnTs在小鼠內(nèi)分泌細胞中的表達與分布的研究
　　 28只CD1小鼠（8-10周，重約30克，雄性14只，雌性14只），應(yīng)用金屬自顯影(AMG, autometallography)檢測zinc在具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰

11、腺，睪丸和卵巢）中的分布。應(yīng)用Real time PCR和免疫組化技術(shù)檢測ZnTs mRNA和蛋白在上述具有內(nèi)分泌功能的器官中的表達和分布。
　　 2、鋅轉(zhuǎn)運體ZnT8參與睪酮分泌的分子機制研究
　　 雄性CD1乳鼠（15天，重約9克）給予hCG處理后，應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測ZnT8與StAR在睪丸間質(zhì)細胞中的表達與分布;應(yīng)用AMG和免疫組化技術(shù)等檢測hCG對乳鼠血清睪酮濃度，睪丸間質(zhì)細胞鋅離子，ZnT8表達的影響

12、。小鼠睪丸間質(zhì)細胞瘤細胞（MLTC-1）給予高鋅、低鋅、ZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾處理后，檢測孕酮水平，cAMP，PKA活性的水平，以及鋅離子分布的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測ZnT8、StAR和P-StAR以及睪酮合成過程快速通路和慢性通路中的酶的表達，以及cAMP-PKA途徑和MAPK通路中的相關(guān)蛋白的表達。
　　 實驗結(jié)果:
　　 一、鋅和鋅轉(zhuǎn)運體ZnTs在小鼠內(nèi)分泌細胞中的表達
　

13、　 1、ZnT1-10 mRNA在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的表達
　　 Real time PCR結(jié)果顯示，ZnT1-10 mRNA在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，甲狀腺，胰腺，腎上腺，睪丸和卵巢）中均有表達，但是表達含量不同，只有ZnT10 mRNA在胰腺中沒有表達。ZnT1 mRNA在垂體和甲狀腺中高表達，在胰腺表達量最低。ZnT2 mRNA在垂體和卵巢中表達量相對最低。ZnT

14、3 mRNA的表達量在甲狀腺和睪丸中較高，在垂體，胰腺，腎上腺和卵巢中表達量極低，幾乎檢測不到。ZnT4 mRNA和ZnT6 mRNA在檢測的器官中表達情況相似，甲狀腺和睪丸中高表達，ZnT4 mRNA在卵巢中次之，也高于其他器官，其余器官的表達水平相似，而ZnT6 mRNA在垂體和卵巢中表達高于胰腺和腎上腺。ZnT5 mRNA表達量在垂體，甲狀腺，胰腺，睪丸，腎上腺和卵巢中依次遞減。ZnT7 mRNA在睪丸中表達最高，垂體和胰腺次之，

15、在其余器官中低表達。ZnT8 mRNA的表達水平在胰腺中最高，在其他的內(nèi)分泌器官也有表達，但是表達水平顯著低于胰腺。ZnT9mRNA豐富表達在垂體和卵巢，高于其他器官的表達水平。ZnT10 mRNA在被檢測器官中的表達水平最低，低于其他的ZnTs mRNA，ZnT10 mRNA在垂體中相對高表達，在胰腺中不表達。
　　 2、ZnT1-10蛋白在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的分布
　　

16、 (1) ZnTs蛋白在腺垂體中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在腺垂體的嗜酸性細胞和嗜堿性細胞胞質(zhì)中，ZnT3-5和ZnT8在嫌色細胞中也有陽性反應(yīng)，但是ZnT1，ZnT2與ZnT7只有微弱陽性染色或陰性的反應(yīng)。
　　 (2) ZnTs蛋白在腎上腺中的分布
　　 所有的ZnTs均在腎上腺中表達，ZnT1，ZnT3，ZnT4，ZnT7和ZnT8分布在腎上腺皮質(zhì)的球狀帶

17、，束狀帶和網(wǎng)狀帶細胞中，ZnT2，ZnT5和ZnT10在球狀帶的陽性反應(yīng)較弱，ZnT1，ZnT3，ZnT7和ZnT8在腎上腺髓質(zhì)中高表達，ZnT4，ZnT5和ZnT10在腎上腺髓質(zhì)中呈陰性反應(yīng)。
　　 (3) ZnTs蛋白在甲狀腺中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在甲狀腺濾泡上皮細胞和濾泡旁細胞的細胞質(zhì)中。
　　 (4) ZnTs蛋白在胰腺中的分布
　　 除了Z

18、nT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白在胰島細胞胞質(zhì)中均呈陽性免疫反應(yīng)，但是ZnT3的免疫染色較弱。
　　 (5) ZnTs蛋白在睪丸中的分布
　　 所有的ZnTs均表達在睪丸間質(zhì)細胞中的細胞質(zhì)，ZnT7也高表達在曲細精管中的精母細胞和精子細胞。
　　 (6) ZnTs蛋白在卵巢中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8高表達在不同時期卵泡細胞中的顆粒細胞，所有的Zn

19、Ts在卵巢黃體中均有強烈的免疫陽性染色反應(yīng)。
　　 3、zinc在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的表達
　　 AMG實驗表明在所檢測的內(nèi)分泌細胞的細胞質(zhì)中均有棕褐色的AMG陽性產(chǎn)物，表明zinc分布在腺垂體細胞，腎上腺皮質(zhì)細胞，甲狀腺濾泡上皮細胞和濾泡旁細胞，胰島細胞，睪丸間質(zhì)細胞，曲細精管，卵巢的卵泡顆粒細胞和黃體。二、鋅轉(zhuǎn)運體ZnT8參與睪酮分泌的分子機制研究
　　 1、

20、免疫熒光雙標(biāo)實驗證實ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睪丸間質(zhì)細胞中共定位。
　　 ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睪丸間質(zhì)細胞中共定位。
　　 2、ZnT8參與hCG誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮生成。
　　 hCG處理乳鼠后，乳鼠血清睪酮濃度升高，睪丸間質(zhì)細胞鋅離子聚集增多，ZnT8蛋白表達水平增多，同時刺激了StAR蛋白的產(chǎn)生。
　　 3、ZnT8介導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細胞瘤細胞（MLTC-1）的鋅

21、離子轉(zhuǎn)運
　　 小鼠睪丸間質(zhì)細胞瘤細胞(MLTC-1)給予高鋅、低鋅、hZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和mZnT8 siRNA干擾處理后，觀察到高鋅組和ZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞所分泌的孕酮水平升高，低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組孕酮水平降低，并且這種變化與hCG處理時間呈正比。同時，TSQ熒光染色實驗顯示hCG處理組，高鋅組和ZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組使MLTC-1細胞中鋅離子聚集增多，而低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組使鋅

22、聚集減少。
　　 4、證實ZnT8介導(dǎo)睪酮的生成是通過快速通路還是慢性通路。
　　 小鼠睪丸間質(zhì)細胞瘤細胞（MLTC-1）給予高鋅、低鋅、hZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和mZnT8 siRNA干擾處理后，Western blot結(jié)果顯示快速通路中P-StAR蛋白在高鋅組和ZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達升高，總StAR蛋白在各組間沒有變化;慢性通路中總StAR，3β-HSD和P450scc均在低鋅組表達降低，這說明ZnT8介導(dǎo)睪酮

23、的生成是通過快速通路。
　　 5、不同處理因素對MLTC-1細胞中cAMP-PKA途徑和P-ERK1/2表達水平的影響。
　　 不同處理因素組對MLTC-1細胞的cAMP和PKA水平引起變化，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義;Western blot結(jié)果顯示P-ERK1/2蛋白在高鋅組和ZnT8過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達升高，低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組P-ERK1/2蛋白水平降低，同時在不同處理因素后應(yīng)用ERK抑制劑PD98059

24、，孕酮水平的變化被PD98059所抑制，說明ZnT8在快速通路中通過激活ERK的級聯(lián)反應(yīng)進行調(diào)節(jié)StAR的磷酸化參與睪酮合成的分子機制。
　　 結(jié)論:
　　 1、在具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中
　　 (1) ZnT1-10 mRNA均有表達，但是表達含量不同，ZnT10 mRNA在胰腺中沒有表達。
　　 (2) ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白也均有表達，含量及組織