唾液酸近氨基端結(jié)構(gòu)域功能及脂多糖對(duì)PRRSV誘導(dǎo)IFN-a的影響研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種豬的病毒性傳染病。PRRSV在體內(nèi)主要入侵單核/巨噬細(xì)胞,研究表明這與豬肺泡巨噬細(xì)胞上的病毒受體密切相關(guān),唾液酸粘附素受體在PRRSV侵染PAM細(xì)胞的過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用。唾液酸粘附素受體胞外區(qū)參與PRRSV與PAM細(xì)胞的吸附,本試驗(yàn)通過(guò)研究唾液酸粘附素受體近氨基端第一個(gè)結(jié)構(gòu)域在PRRSV侵染PAM細(xì)胞的過(guò)程中的作用,為探討唾液酸受體對(duì)PRRSV的內(nèi)吞作用打

2、下基礎(chǔ)；在自然條件下,豬感染PRRSV后往往繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌病,革蘭氏陰性菌在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素,內(nèi)毒素在機(jī)體的抗病毒機(jī)制中所發(fā)揮的作用目前還不明確,通過(guò)研究LPS刺激健康PAM細(xì)胞及感染PRRSV的PAM細(xì)胞對(duì)IFN—α和病毒復(fù)制的影響,為進(jìn)一步探討細(xì)菌內(nèi)毒素在誘導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)抑制中的作用打下基礎(chǔ)。
　　 從健康豬肺收集PAM細(xì)胞,提取總RNA,設(shè)計(jì)1對(duì)唾液酸枯附素受體近氨基端第一個(gè)結(jié)構(gòu)域的特異性

3、引物。用RT-PCR方法擴(kuò)增出其近氨基端的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域的基因片段,大小約為450bp,將這基因片段亞克隆到pET-32a載體中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Sn150。在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá),獲得了分子量大小約為36.6KD的重組蛋白Sn150,與預(yù)期的蛋白分子量相符；通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件,大量表達(dá)重組蛋白,用尿素法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化與復(fù)性。用純化蛋白免疫小鼠,制備抗重組蛋白Sn150的多克隆抗體,經(jīng)間接ELISA檢測(cè),效價(jià)為1:1280

4、0。將特異性多抗做免疫印跡,結(jié)果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結(jié)合,表明表達(dá)的重組蛋白具有較好的免疫原性。
　　 根據(jù)GenBank收錄的PRRSV和β-actin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以β-actin為內(nèi)參基因建立檢測(cè)PRRSV的相對(duì)熒光定量方法,該方法擴(kuò)增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰,擴(kuò)增特異性較好。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)PAM細(xì)胞,6h后將鼠抗Sn150血清加入PAM細(xì)胞,封閉1h后接種PRRSV,分別培養(yǎng)6h

5、、12h、15h、18h、24h后,收集細(xì)胞及上清,用建立的real-time PCR方法檢測(cè)PAM細(xì)胞中的病毒的mRNA水平,同時(shí)用健康PAM細(xì)胞作陰性對(duì)照。結(jié)果顯示,鼠抗Sn150特異性抗體封閉后試驗(yàn)組PRRSV mRNA水平在各個(gè)時(shí)間段比對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間段的PRRSV mRNA水平明顯增高,抗Sn150的特異性抗體增強(qiáng)了PRRSV在PAM細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,表明PRRSV進(jìn)入PAM的過(guò)程可能存在更復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 將含200個(gè)

6、TCID50病毒液,接到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的PAM細(xì)胞上,吸附4h后接入100ng/ml的LPS,同時(shí)設(shè)接毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照,分別培養(yǎng)6h、12h、15h、18h、24h后,收集細(xì)胞及上清,用建立的real-time PCR方法檢測(cè)PAM細(xì)胞中的PRRSV mRNA復(fù)制拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,LPS刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞,與未刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞相比,可以使PRRSV轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到頂峰的時(shí)間推遲,PRRSV mRNA水平輕微

7、上調(diào),說(shuō)明LPS可以增強(qiáng)PRRSV在PAM細(xì)胞內(nèi)的增殖。
　　 根據(jù)GenBank收錄的IFN-α基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以β-actin為內(nèi)參基因建立檢測(cè)IFN-α的相對(duì)熒光定量方法,該方法擴(kuò)增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰,擴(kuò)增特異性較好。將含200個(gè)TCID50病毒液,接到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的PAM細(xì)胞上,吸附4h后接入100ng/ml的LPS,同時(shí)設(shè)接毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照,分別培養(yǎng)6h、12h、15h、18h、24h后,收集

8、細(xì)胞及上清,用建立的real-timePCR方法檢測(cè)PAM細(xì)胞中的IFN-α mRNA水平。結(jié)果顯示,與PAM健康細(xì)胞對(duì)照組相比LPS誘導(dǎo)健康PAM細(xì)胞在不同時(shí)間段的IFN-α mRNA水平無(wú)顯著變化,LPS刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞與未刺激的PRRSV感染的PAM細(xì)胞相比,IFN-α轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到頂峰的時(shí)間推遲,并且IFN-α mRNA水平大幅度下調(diào),說(shuō)明LPS抑制PAM細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α；PRRSV感染PAM后與健康PAM細(xì)胞相比