木霉菌REMI突變株耐受Cd機(jī)理及其對油菜富集Cd影響.pdf

1、多年來農(nóng)田土壤重金屬污染是我國農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的主要威脅，因此研究生物修復(fù)農(nóng)業(yè)土壤關(guān)鍵技術(shù)具有重要意義。木霉菌是廣泛分布于植物根圍的有益微生物，除具有防治土傳植物病害的作用外，還發(fā)現(xiàn)可與植物形成共生體(symbiont)聯(lián)合修復(fù)農(nóng)化物質(zhì)對環(huán)境的污染，具有修復(fù)土壤重金屬污染的潛在價(jià)值。因此揭示木霉菌耐受重金屬和與修復(fù)性植物互作的機(jī)理是構(gòu)建木霉菌-植物聯(lián)合修復(fù)農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 本研究是通過限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合(Restr

2、iction enzyme mediated integration,REMI)技術(shù)構(gòu)建并篩選獲得耐受Cd的木霉菌突變株，研究突變株耐受Cd及其對甘藍(lán)型油菜富集Cd的影響，主要結(jié)果如下：
　　 以康氏木霉(Trichoderma koningii) T30為出發(fā)菌，利用REMI技術(shù)檢構(gòu)建了200株突變株，篩選獲得10株耐受Cd突變株，與野生株(T30)相比，突變株平均耐受Cd的IC50值增加1.5～2倍。去Cd率達(dá)到23～39％

3、，提高3～4倍。其中，突變株P(guān)6是最理想的突變株。REMI誘變技術(shù)提高了木霉菌對Cd引起的氧化脅迫效應(yīng)的耐性水平。在Cd脅迫下，P6的MDA峰值小于T30，O2-峰值低且出現(xiàn)時間遲于野生株。P6的CAT被Cd脅迫誘導(dǎo)，活性迅速增加，4h時達(dá)峰值，增加31%。而T30僅有微小的增加。P6的SOD在4h峰值時增加45%，而T30在8h才出現(xiàn)峰值。P6中的GSH受Cd誘導(dǎo)最高增加1.6倍，T30最高增加2.3倍。
　　 電鏡觀察表明：

4、Cd主要在P6的細(xì)胞壁和液泡內(nèi)富集，REMI突變可提高木霉菌細(xì)胞膜系統(tǒng)抗Cd損害性。P6吸附Cd后FTIR譜圖發(fā)生顯著變化，胞壁羥基、羧基和蛋白殘基是結(jié)合Cd的主要基團(tuán)。P6菌絲體在液體中吸附Cd的過程符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程(R2=0.9938)，1h基本達(dá)到吸附平衡，平衡吸附量為33.2mg/g。在18～47℃的范圍內(nèi)溫度對吸附影響不顯著。吸附量隨pH增加而增加。能量抑制劑疊氮化鈉僅能部分抑制吸附。
　　 通過質(zhì)粒搶救和RACE

5、技術(shù)從木霉菌中克隆了耐受Cd的相關(guān)基因，tkpah。該基因?qū)儆诹字窤2家族GVⅡ亞群（GVⅢPLA2）。cDNA全長1，719bp，有一個65bp的內(nèi)含子。同源重組敲除T30中的tkpah，Cd脅迫試驗(yàn)顯示，敲除子菌絲和孢子對Cd耐性均有不同程度的提高，其中敲除子孢子對Cd和H2O2脅迫的耐受性增強(qiáng)最為明顯。說明該基因可能負(fù)調(diào)控木霉菌孢子對Cd的耐受性。
　　 P6菌絲蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明：Cd脅迫后的菌絲蛋白質(zhì)發(fā)生明顯應(yīng)答反應(yīng)

6、，表現(xiàn)為總蛋白點(diǎn)數(shù)明顯較少，出現(xiàn)16個上調(diào)兩倍以上蛋白點(diǎn)和26個特異誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白點(diǎn)。經(jīng)MALDI-TOF-TOF MS鑒定，發(fā)現(xiàn)多種耐Cd脅迫蛋白如熱激蛋白、磷酸甘油酸變位酶、泛素蛋白連接酶等。
　　 盆栽試驗(yàn)表明：P6增強(qiáng)了甘藍(lán)型油菜(滬油17和滬油20)對土壤Cd脅迫的耐受，促進(jìn)油菜對土壤Cd的吸附。與CK和野生株(T30)接種處理相比，在20mgkg-1Cd污染的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織干重分別增加21%和2

7、0%，滬油20則分別增加44%和24%;在50mgkg-1Cd污染的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織干重分別增加53%和31%，滬油20則分別增加16%和17%。P6還增加了油菜地上部組織Cd濃度。與CK和T30處理相比，在20mgkg-1Cd的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織中的Cd濃度分別增加27%和13%，滬油20則分別增加8%和6%:在50mgkg-1Cd的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織中的Cd濃度分別增加35%和