豬藍(lán)耳病感染與免疫的分子鑒別方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom Virus，PRRSV)主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬呼吸困難、高死亡率，具有傳播快、流行范圍廣、高度傳染性等特點(diǎn)，特別是“高致病性豬藍(lán)耳病”幾乎蔓延全國(guó)各地，造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于本病同其他引起豬繁殖障礙的疾病表現(xiàn)出極為相似的臨床癥狀，并由于新流行毒株的基因發(fā)生了突變，毒力增強(qiáng)，特別是豬群出現(xiàn)了

2、PRRSV與其他病原如豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等的混合感染，表現(xiàn)為癥狀、病變的非典型化和復(fù)雜化，給豬群的臨床診斷和防疫帶來(lái)新的難度。為了有效控制PRRS，我國(guó)豬群大量使用PRRSV疫苗。由于PRRSV滅活疫苗在臨床使用的防疫效果不穩(wěn)定，目前多用PRRSV弱毒疫苗，而大部分豬群接種PRRSV弱毒疫苗以后，將出現(xiàn)一定時(shí)期的病毒血癥，豬體長(zhǎng)期帶毒，甚至排毒，豬群一旦感染自然界的野毒，將很難進(jìn)行鑒別，不利于PRRSV的臨床診斷和控制。因此，有必要建

3、立一套能夠區(qū)分PRRSV自然感染與疫苗免疫的快速鑒別診斷技術(shù)。
　　RT-PCR方法是一種可以快速檢測(cè)血液、精液以及組織樣品中病毒核酸的生物技術(shù)。利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR還可以區(qū)分不同基因型的病毒株。PRRSV的ORF5基因和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)的Nsp2基因是基因組高度變異的區(qū)域，而且目前發(fā)現(xiàn)的PRRSV基因缺失主要集Nsp2基因中，GP5和Nsp2蛋白的變異會(huì)導(dǎo)致病毒毒力和致病性的差異。本論文開(kāi)展了兩方面的工作，

4、一是建立了常規(guī)RT-PCR方法，二是用本文建立的常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)了2011～2014年的部分送檢樣品。結(jié)果如下:
　　1.常規(guī)RT-PCR方法的建立
　　本研究根據(jù)PRRSV基因編碼區(qū)中變異最大的GP5和非編碼區(qū)中變異最大的Nsp2兩個(gè)目的片段，設(shè)計(jì)了2對(duì)GP5引物（P1和P2）和5對(duì)Nsp2引物（N1和N5），克隆了GP5和Nsp2基因，從中各篩選優(yōu)化出一套效果最好的引物（P2和N3）構(gòu)建了兩套常規(guī)RT-PCR，并

5、進(jìn)行了特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，本文建立的常規(guī)RT-PCR僅能擴(kuò)增出PRRSV毒株，不擴(kuò)增豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬流感病毒等毒株。擴(kuò)增GP5雙鏈DNA的靈敏度為700拷貝，擴(kuò)增GP5基因組的靈敏度為稀釋106倍;擴(kuò)增Nsp2雙鏈DNA的靈敏度為80拷貝，擴(kuò)增Nsp2基因組的靈敏度為稀釋107倍。結(jié)果表明，本文建立的常規(guī)RT-PCR具有良好的特異性和較高的靈敏度，可用于臨床

6、檢測(cè)。
　　2.常規(guī)RT-PCR方法的臨床應(yīng)用
　　采用本文建立的常規(guī)RT-PCR方法，對(duì)2011～2014年送檢的329批血樣、組織病料等進(jìn)行了檢測(cè)。首先，對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性樣品測(cè)序后建立了PRRSV序列庫(kù)，用DNAstar同源性分析軟件對(duì)P2引物擴(kuò)增得到的全部序列及送檢單位使用的疫苗序列進(jìn)行對(duì)比分析，并對(duì)4家豬場(chǎng)近4年的陽(yáng)性序列分別進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用本文所構(gòu)建的常規(guī)RT-PCR方法能明顯區(qū)分野毒株與疫苗株;而且用N3引物