孕期和哺乳期輕度碘缺乏導(dǎo)致低甲狀腺素血癥損傷仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)育和長時程突觸可塑性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 碘是人體內(nèi)必不可少的微量元素，是甲狀腺分泌合成T3和T4的重要原料。碘缺乏是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的最常見原因。隨著全球公共健康的不斷改善，碘缺乏引起的低甲狀腺素血癥在發(fā)展中國家和一些發(fā)達(dá)國家中普遍存在。血清中游離四碘甲狀腺氨酸（free thyroxine，F(xiàn)T4）下降，但游離三碘甲狀腺氨酸（freetriiodothyronine，F(xiàn)T3）和促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone

2、, TSH)卻無明顯變化，被稱為低甲狀腺素血癥。輕度碘缺乏被公認(rèn)為是母體和新生兒發(fā)生低甲狀腺素血癥的最常見原因。母體低甲狀腺素血癥能增加子代神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險，造成子代不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。軸突發(fā)育和髓鞘形成是神經(jīng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路形成和認(rèn)知功能的正常作用。長時程增強(qiáng)是突觸傳遞的長時程突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式之一，是研究學(xué)習(xí)記憶過程的突觸模型。磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（以下簡稱為PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑）同突觸可塑性

3、形成和學(xué)習(xí)記憶過程有著密切聯(lián)系。母體孕期和哺乳期輕度碘缺乏所致的低甲狀腺素血癥對后代的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和認(rèn)知功能損傷機(jī)制尚不清楚，其對腦發(fā)育過程中子代海馬軸突發(fā)育、髓鞘形成及長時程突觸可塑性的影響作用如何也有待研究。本研究在母鼠孕期和哺乳期采用輕度碘缺乏飲食建立低甲狀腺素血癥模型，研究仔鼠腦發(fā)育過程中軸突發(fā)育和髓鞘形成的改變及其影響機(jī)制;并探究仔鼠神經(jīng)電生理學(xué)的表現(xiàn)，及神經(jīng)電生理后海馬CA1區(qū)PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變，以期在蛋白分子和信號

4、轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上闡明孕期和哺乳期輕度碘缺乏所致低甲狀腺素血癥損害后代神經(jīng)發(fā)育和長時程突觸可塑性的機(jī)制。
　　 實驗方法:
　　 一、實驗動物與分組
　　 健康雌性Wistar大鼠，按體重隨機(jī)分成4組:對照組、輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組，各組均飼以缺碘地區(qū)糧食配制的飼料，飲用加入不同劑量的KI去離子水，4組雌鼠每日總碘攝入量依次為:7.0μg/d、3.0μg/d、1.5μg/d和7.0μg/d。雌鼠飼養(yǎng)3個月后

5、，交配妊娠。各組取孕鼠20-21只，至妊娠0天，記為GD0開始直至仔鼠生后(postnatal day，PN)第21天，對照組、輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組飲食同前，MMZ組在飲水中加入0.02％MMZ。PN21后，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組的飼養(yǎng)同對照組相同。在整個實驗過程中，測定母鼠及仔鼠體重，觀察仔鼠開眼情況。
　　 二、母鼠和仔鼠血清FT4、FT3、TSH測定
　　 分別于母鼠GD0、GD19和PN21，

6、仔鼠PN7、PN14、PN21和PN80時，心臟采血，5000rpm離心10min，分離血清。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測定血清中FT4、FT3、TSH含量。
　　 三、母鼠甲狀腺重及甲狀腺碘含量的測定
　　 分別于母鼠GD19和PN21取母鼠甲狀腺，稱重后-70℃凍存。采用砷鈰催化分光光度計法測定甲狀腺中的碘濃度(μg/g)。碘濃度(μg/g)和甲狀腺重(g)的乘積作為整個甲狀腺的碘含量(μg)。
　　 四、母鼠甲

7、狀腺相關(guān)蛋白測定分析
　　 分別于母鼠GD19和PN21時，每組選取5只母鼠，剝離甲狀腺，采用westernblot方法分別測定甲狀腺TTF1、PAX8、NIS、DIO1和DIO2的蛋白水平。全自動凝膠成像分析系統(tǒng)照相，測得各條帶的凈光密度值。
　　 五、仔鼠海馬軸突和髓鞘的形態(tài)學(xué)研究
　　 分別于GD19、PN7、PN14和PN21時每組取5只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定大腦，石蠟包埋，切片。在GD19、PN7、

8、PN14和PN21時，海馬CA3區(qū)CRMP2和Tau1免疫熒光組織化學(xué)染色，觀察仔鼠海馬軸突形態(tài)學(xué)改變;在PN14和PN21時，海馬CA1、CA3和DG區(qū)MBP免疫熒光組織化學(xué)染色和Luxol Fast Blue髓鞘染色，觀察仔鼠海馬髓鞘形態(tài)學(xué)改變。用圖象分析系統(tǒng)及圖象分析軟件分析海馬各蛋白表達(dá)的熒光平均強(qiáng)度。
　　 六、仔鼠海馬軸突發(fā)育和髓鞘形成相關(guān)蛋白的western blot測定分析
　　 分別于GD19、PN7、

9、PN14和PN21時，每組選取5只仔鼠，斷頭取腦，剝離海馬。采用western blot方法分別測定GD19、PN7、PN14和PN21時，海馬GAP-43、Sema3A、GSK3β、p-GSK3β、CRMP2和p-CRMP2的蛋白水平;測定在PN14和PN21時，海馬Olig2、MBP、PLP、MAG和CNPase的蛋白水平。
　　 七、仔鼠海馬長時程突觸可塑性的測定
　　 在PN80時，將仔鼠麻醉后，固定在立體定位儀

10、上。將刺激電極插入左側(cè)海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞層;記錄電極插入左側(cè)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層。作基線記錄30分鐘后，給予100Hz高頻刺激5秒鐘。觀察海馬CA3-CA1區(qū)突觸可塑性變化。計算PS幅值和f-EPSP斜率，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 八、仔鼠PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的測定
　　 在神經(jīng)電生理實驗完成后（即PN80時），立刻每組隨機(jī)取3只仔鼠，灌流固定，石蠟包埋、切片后，免疫熒光組織化學(xué)染色，觀察海馬CA1區(qū)p-AKT和NeuN

11、免疫雙標(biāo)的熒光表達(dá)。每組隨機(jī)取4只仔鼠，斷頭取腦，剝離海馬，分離CA1區(qū)后，采用western blot方法分別測定海馬CA1區(qū)PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各蛋白的水平。
　　 九、統(tǒng)計分析
　　 結(jié)果表示為mean±SD。全部數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異，當(dāng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，用SNK進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果:

12、r>　　 一、孕期和哺乳期輕度碘缺乏引起母鼠和仔鼠發(fā)生低甲狀腺素血癥
　　 在母鼠GD19和PN21和仔鼠PN7、PN14和PN21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組的FT4水平顯著低于對照組(P＜0.05)。輕度碘缺乏組的FT3水平略低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義;重度碘缺乏組和MMZ組的FT3水平顯著低于對照組和輕度碘缺乏組(P＜0.05)。輕度碘缺乏組的TSH水平略高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義;重度碘缺乏組和MMZ組的T

13、SH水平顯著高于對照組和輕度碘缺乏組(P＜0.05)。在母鼠GD0時，輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組的FT4水平顯著低于對照組(P＜0.05);輕度碘缺乏組的FT3水平略低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義;重度碘缺乏組FT3水平顯著低于對照組和輕度碘缺乏組(P＜0.05)。輕度碘缺乏組的TSH水平略高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義;重度碘缺乏組的TSH水平顯著高于對照組和輕度碘缺乏組(P＜0.05);而MMZ組各激素水平正常。在仔鼠PN80時，各組激素水

14、平基本恢復(fù)到正常水平。
　　 二、孕期和哺乳期輕度碘缺乏增加母鼠甲狀腺重及降低甲狀腺碘含量
　　 孕期和哺乳期時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組母鼠甲狀腺重顯著高于對照組(P＜0.05)。孕期和哺乳期時，輕度碘缺乏組和重度碘缺乏組母鼠甲狀腺碘含量顯著低于對照組(P＜0.05); MMZ組母鼠甲狀腺碘含量正常。
　　 三、孕期和哺乳期輕度碘缺乏降低母鼠甲狀腺相關(guān)蛋白表達(dá)水平
　　 在母鼠GD19和PN

15、21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組的母鼠甲狀腺TFF1、PAX8、NIS、DIO1和DIO2蛋白水平顯著高于對照組(P＜0.05)。在GD19，重度碘缺乏組和MMZ組的母鼠甲狀腺TTF1、PAX8、NIS、DIO1和DIO2蛋白表達(dá)則顯著高于對照組和輕度碘缺乏組(P＜0.05)，具統(tǒng)計學(xué)意義;而在PN21，重度碘缺乏組和MMZ組的母鼠甲狀腺DIO1和DIO2蛋白表達(dá)則顯著高于對照組和輕度碘缺乏組(P＜0.05)，具統(tǒng)計學(xué)意義。

16、
　　 四、孕期和哺乳期輕度碘缺乏所致低甲狀腺素血癥損傷仔鼠海馬軸突和髓鞘形態(tài)學(xué)
　　 GD19、PN7、PN14和PN21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬CA3區(qū)CRMP2和Tau1陽性染色分布顯著低于對照組(P＜0.05)。PN14時，輕度碘缺乏組仔鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)MBP陽性染色分布略低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義;PN21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)

17、MBP陽性染色分布明顯低于對照組(P＜0.05); PN14和PN21時，與對照組相比，鏡下可見輕度碘缺乏組仔鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Luxol FastBlue髓鞘染色有髓軸突數(shù)量少，可見有髓軸突排列紊亂、扭曲或斷裂現(xiàn)象;重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Luxol Fast Blue髓鞘染色的有髓軸突則更為紊亂。
　　 五、孕期和哺乳期輕度碘缺乏所致低甲狀腺素血癥改變仔鼠海馬軸突發(fā)育和髓鞘形成相關(guān)蛋白表

18、達(dá)
　　 GD19、PN7、PN14和PN21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬GAP-43、CRMP2、p-GSK3β蛋白水平顯著低于對照組(P＜0.05)，海馬Sema3A和p-CRMP2蛋白水平顯著高與對照組(P＜0.05)。PN14和PN21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬Olig2蛋白水平顯著低于對照組(P＜0.05); PN14時，輕度碘缺乏組仔鼠海馬MBP、PLP、MAG和CNPase

19、蛋白水平較對照組略微下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義;而PN21時，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬MBP、PLP、MAG和CNPase蛋白水平顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 六、孕期和哺乳期輕度碘缺乏所致低甲狀腺素血癥損傷仔鼠海馬CA1區(qū)LTP
　　 PN80時，與對照組相比，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬CA1區(qū)f-EPSP斜率和PS幅值顯著降低(P＜0.05)，并且基本維持在同一水平30分鐘。

20、
　　 七、孕期和哺乳期輕度碘缺乏所致低甲狀腺素血癥下調(diào)仔鼠 PI3 K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性
　　 在神經(jīng)電生理學(xué)實驗后，與對照組相比，輕度碘缺乏組、重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬CA1區(qū)p-AKT和NeuN陽性雙標(biāo)染色的神經(jīng)元減少;輕度碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)p-PDK1和p-AKT蛋白表達(dá)水平略低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義;重度碘缺乏組和MMZ組仔鼠海馬CA1區(qū)p-PDK1、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著低于對