復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf對(duì)淡水浮游細(xì)菌可培養(yǎng)性的影響.pdf

1、自然環(huán)境中大量微生物處于VBNC(Viable but Nonculturable)狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室中微生物的可培養(yǎng)性通常不足1％。造成微生物可培養(yǎng)性低的原因很多，其中一個(gè)主要的原因是實(shí)驗(yàn)室條件下缺乏細(xì)胞間交流的信號(hào)因子。過低的可培養(yǎng)性已經(jīng)成為篩選新型天然活性產(chǎn)物的瓶頸。 革蘭氏陰性菌通常采用小分子化合物作為細(xì)胞與細(xì)胞間交流的信號(hào)分子。在培養(yǎng)基中加入QS(Quorum Sensing)信號(hào)系統(tǒng)中的?；呓z氨酸環(huán)內(nèi)酯(N-acyl h

2、omoserine lactones，AHLs)和參與大多數(shù)革蘭氏陰性菌基因調(diào)控的cAMP均能有效提高海水和淡水中浮游細(xì)菌的可培養(yǎng)性。但作為生物活性物質(zhì)重要來源的放線菌屬于革蘭氏陽性菌，而革蘭氏陽性菌通常使用寡肽作為信號(hào)分子。復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf(Resuscitation promoting factor)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌的細(xì)胞因子，在皮摩爾濃度下便能促進(jìn)休眠期的細(xì)菌復(fù)蘇和生長(zhǎng)。Rpf家族蛋白廣泛分布于革蘭氏陽性菌中，高度保守并具有

3、種間活性。 本文通過在大腸桿菌中克隆表達(dá)結(jié)核分枝桿菌H<,37>Rv rpfC，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Ni<'2+> Sepharose純化可溶性重組蛋白；同時(shí)制備藤黃微球菌在LMM培養(yǎng)基中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期上清(含天然Rpf)。純化后的rRpfC及藤黃微球菌上清均能顯著縮短休眠狀態(tài)的藤黃微球菌低密度接種(100cells/mL)到基本培養(yǎng)基(LMM)中的延滯期。在重慶北碚縉云山黛湖采集水樣，測(cè)定樣品非生物因素：溫度15/8℃，pH 7.

4、38，TOC 4.91mg/mL，COD<,Cr>27.5mg/mL。部分水樣2％戊二醛固定，PI染色，熒光顯微鏡535nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察計(jì)算得出黛湖浮游細(xì)菌含量為1.29x10<'6>cells/ml。將樣品做10倍梯度稀釋，MPN法測(cè)得添加rRpfC及藤黃微球菌上清后水樣中浮游細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù)量約占細(xì)菌總數(shù)的0.2％，與對(duì)照相當(dāng)。通過改良的試劑盒法抽提宏基因組DNA及MPN法培養(yǎng)后的細(xì)菌總DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA V3-V5區(qū)