糖尿病患者唾液中3種氨基酸光學異構體定量分析方案及其應用.pdf

1、糖尿病是威脅人類健康的第三大疾病，可在初期階段因無痛無癢,沒有明顯的癥狀，往往得不到早期的診斷和治療,所以有待開發(fā)低侵襲性的早期診斷方法。唾液是人體重要的體液之一，可以作為診斷疾病的生物樣品，但目前尚未有將其應用于糖尿病診斷的文獻報道。
　　本研究首次建立并完善了一種能夠應用于人體唾液中氨基酸光學異構體定量的超高效液相（UPLC）-熒光（FL）分析方法。本文以人體唾液為生物樣品，設計開發(fā)了D,L-丙氨酸（Alanine，Ala）、

2、D,L-纈氨酸（Valine，Val）、D,L-亮氨酸（Leucine，Leu）3種D,L-氨基酸的UPLC-FL技術。以6-Aminocaproic acid(Internal standard;IS)為內(nèi)標物，用熒光衍生化試劑R(-)-4-N，N-二甲基磺酰胺-7-（3-異氰酸吡咯烷）-2,1,3-苯并氧雜咪唑，即R(-)-DBD-PyNCS與3種D,L-氨基酸光學異構體以及3％的三乙胺在55℃下加熱20分鐘進行衍生化反應；用BEH

3、 C18(1.7m,100mm×2.1mm i.d.)色譜柱,以0.2%的甲酸水溶液和0.2%的甲酸乙腈溶液為流動相，進行梯度洗脫；利用UPLC-FL在激發(fā)波長（Ex）：460nm，熒光波長（Em）：550nm處進行衍生化產(chǎn)物的檢測。在20分鐘內(nèi)3種D，L-氨基酸的分離度（Rs）大于1.5，達到了完全分離。標準曲線范圍內(nèi)線性關系良好（r2≥0.9988）；最低檢測限為10.0-200fmol；日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10.44％；加

4、樣回收率為95.2-109.6%，均滿足生物樣品測定的要求。本方法準確、靈敏、可靠、專屬性強，可用于人體唾液中3種D,L-氨基酸的定量。
　　利用健康者及糖尿病患者的唾液，建立了3種氨基酸光學異構體定量分析方案，并探討其在糖尿病診斷中的可行性。收集了17名健康受試者的唾液（男性10名、女性7名）；以HbA1C為診斷指標，收集了28名糖尿病受試者的唾液（男性15名、女性13名）。在受試的健康者及糖尿病患者的唾液中均檢測出3種D，L-

5、氨基酸。糖尿病癥受試者唾液中的3種D,L-氨基酸平均含量明顯高于健康受試者。健康者的男性與糖尿病的男性受試者的唾液中L-Ala、D,L-Val、D,L-Leu有顯著性差異（p＜0.05），而D-Ala沒有顯著性差異；全體健康者與糖尿病癥受試者的唾液中D,L-Ala、D,L-Val、L-Leu有顯著性差異（p＜0.01）,而D-Leu沒有顯著性差異。因此，L-Ala、D,L-Val、L-Leu的定量值可作為一種糖尿病癥診斷的新的生物標記物