類黃酮調(diào)控基因AtMYB12的異源表達(dá)及其對(duì)植物抗病性的貢獻(xiàn).pdf

1、生物類黃酮（bioflavonoids）是自然界存在的一大類酚類物質(zhì)次生代謝產(chǎn)物，在自然界中廣泛存在并具有抗氧化、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、防癌等作用。當(dāng)前滿足市場(chǎng)需求的途徑主要通過(guò)依賴化學(xué)方法從天然材料如銀杏葉、洋蔥、檸檬、各種中藥材等中提取。
　　本研究利用番茄果實(shí)特異性表達(dá)啟動(dòng)子E4、PG、2A12驅(qū)動(dòng)擬南芥中生物類黃酮的特異性調(diào)控因子AtMYB12基因在番茄中表達(dá)，獲得一系列富含類黃酮（蘆丁、山奈酚蕓香糖苷和柚皮

2、素查爾酮）的番茄轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步驗(yàn)證了擬南芥中生物類黃酮的特異性調(diào)控因子AtMYB12基因的功能，比較了不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtMYB12基因調(diào)控類黃酮累積的差異，為進(jìn)一步利用番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)類黃酮組分物質(zhì)提供參考。
　　首先，本研究利用不同果實(shí)特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtMYB12基因轉(zhuǎn)化番茄品種并研究了其調(diào)控合成類黃酮類物質(zhì)的能力。采用pX6-GFP載體、高保真PCR技術(shù)，通過(guò)分步克隆策略，分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體pX6-E4::At

3、MYB12、pX6-PG::AtMYB12和pX6-2A12::AtMYB12，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌工程菌株AGL1。通過(guò)葉盤法轉(zhuǎn)化番茄品種圣女果或俏美人，分別獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。高壓液相色譜(HPLC)法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)材料，結(jié)果顯示三個(gè)載體pX6-E4::AtMYB12、pX6-PG::AtMYB12和pX6-2A12::AtMYB12的轉(zhuǎn)基因果實(shí)果皮中均可檢測(cè)到類黃酮類物質(zhì)的提高，其中柚皮素查爾酮在轉(zhuǎn)基因果皮中含量顯著提高。三個(gè)不同啟動(dòng)

4、子能夠?qū)е禄虮磉_(dá)量和轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中物質(zhì)的含量不同，E4啟動(dòng)子能夠調(diào)控AtMYB12基因在果肉中高效表達(dá)，并引起下游參與類黃酮合成基因的上調(diào)表達(dá)，PG和2A12啟動(dòng)子能夠調(diào)控AtMYB12基因在果皮中表達(dá)，同時(shí)引起下游參與類黃酮合成基因的上調(diào)表達(dá)。
　　其次，利用煙草遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究了其它預(yù)測(cè)類黃酮或咖啡酰奎尼酸合成相關(guān)基因的功能。將AtMYB12基因的同源基因AtMYB11在轉(zhuǎn)入三生煙草后也起到與AtMYB12基因相同的效果，

5、提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株中類黃酮類物質(zhì)的含量，但是也同樣沒有激活下游次生代謝產(chǎn)物咖啡?？崴岬暮铣?。轉(zhuǎn)基因煙草植株中，單獨(dú)超量表達(dá)NtHCT、NtHQT、NtC3H均沒有引起下游次生代謝產(chǎn)物咖啡酰奎尼酸的合成，但是NtHQT基因的超量表達(dá)后的HPLC結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草中蘆丁的含量有所下降，推測(cè)可能由于新的未知物質(zhì)的合成而阻礙或降低了蘆丁的合成。
　　進(jìn)而分析了類黃酮累積的煙草轉(zhuǎn)基因株系的抗病性狀，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)AtMYB12基因的煙草植株中由

6、于蘆丁含量的提高而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)煙草青枯病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌的抗性提高，但轉(zhuǎn)基因植株對(duì)供試PVY病毒株系表現(xiàn)更加敏感。轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗病反應(yīng)提高，主要是由于轉(zhuǎn)基因煙草在接種病原后抗病相關(guān)基因的迅速高效表達(dá)，從而引起植株對(duì)多種病害的抗性。而且轉(zhuǎn)基因煙草提取物的平板抑菌試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了蘆丁等類黃酮物質(zhì)對(duì)細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)具有一定的抑制效果。轉(zhuǎn)基因的番茄果實(shí)由于蘆丁含量的提高也對(duì)番茄灰霉病表現(xiàn)抗性，同時(shí)蘆丁的平板抑菌試驗(yàn)進(jìn)一

7、步證實(shí)了蘆丁對(duì)番茄灰霉病的抗性效果。
　　生物類黃酮作為植物的一大類次生代謝產(chǎn)物的總稱，不僅是植物生長(zhǎng)和防御反應(yīng)中所必須的，同時(shí)也對(duì)人體有非常顯著且良好的效果，我們通過(guò)栽培型小果番茄和重要經(jīng)濟(jì)作物煙草作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)類黃酮生物制品，得到具有無(wú)選擇標(biāo)記的番茄新品種和高含類黃酮和咖啡?？崴岬臒煵菪缕贩N，為進(jìn)行品種培育和產(chǎn)業(yè)化加工奠定基礎(chǔ)。同時(shí)蘆丁作為一種植物的次生代謝產(chǎn)物，可以作為煙草植株抗病反應(yīng)的激發(fā)子，誘導(dǎo)調(diào)控?zé)煵葜仓陮?duì)多種病