IFN-γ誘導(dǎo)自噬不足通過p62蛋白引起慢性鼻-鼻竇炎中上皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景：自噬是細(xì)胞內(nèi)通過溶酶體途徑吞噬、降解老化的細(xì)胞器或入侵的細(xì)菌，病毒等，在細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化，抵御外界刺激，質(zhì)量平衡方面發(fā)揮著重要的作用。但是如果自噬不足或自噬障礙則與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。此外，目前自噬狀態(tài)或改變?cè)诼员潜歉]炎伴鼻息肉的疾病中研究的很少。
　　研究目的：研究自噬流相關(guān)蛋白在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中定位及表達(dá)，以及其與上皮細(xì)胞凋亡的研究。
　　研究方法：（1）免疫組化及免疫印記方法(western blot;

2、 WB)檢測(cè)慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織及上皮細(xì)胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：與自噬相關(guān)的蛋白包括：微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3β-Ⅱ(microtubule-associated protein1 light chain3B(LC3B)-Ⅱ),自噬相關(guān)蛋白3，5,7（autophagy-related protein(Atg)3, Atg5, Atg7）；B淋巴細(xì)胞-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting protein; Becl

3、in1)；底物蛋白p62蛋白,泛素化蛋白（ubiquitinated protein）；溶酶體標(biāo)志物：溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosomal-associated membrane protein1; LAMP-1).凋亡相關(guān)蛋白包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3，-8（cysteine-aspartic protease(caspase)-3；caspase-8）；聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polym

4、erase；PARP）.
　?。?）電鏡觀察慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織及上皮細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的改變。
　?。?）western blot檢測(cè)慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細(xì)胞中自噬流的變化：分別用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1；Baf A1）和自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(rapamycin; Rapa)來刺激慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細(xì)胞，觀察自噬流（LC3B, p62）及凋亡(cleaved PARP

5、)的改變。
　?。?）western blot檢測(cè)siNS或sip62后慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細(xì)胞中凋亡的改變：用20 nM siNS或 sip62轉(zhuǎn)染鼻息肉上皮細(xì)胞，48小時(shí)后觀察 p62, caspase-8, caspase-3的表達(dá)變化。
　?。?）刺激BEAS-2B細(xì)胞系篩選引起鼻息肉上皮細(xì)胞中自噬不足的上游因子：分別用白介素（interleukin（IL）-4,-13,-17A）或干擾素-γ（interfer

6、on–gamma；IFN-γ）或聚肌苷酸-聚胞苷酸（polyinosinic: polycytidylic acid；poly(I:C)；dsRNA）, or脂多糖（lipopolysaccharides；LPS）刺激BEAS-2B細(xì)胞系，western blot觀察LC3B, p62, ubiquitinated proteins,及凋亡的改變。
　?。?）篩選出的INF-γ刺激正常鼻粘膜上皮細(xì)胞（nasal epithelia

7、l cells；NECs）觀察自噬和凋亡的改變：用IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮細(xì)胞（NECs）,通過western blot檢測(cè)觀察LC3B, p62, ubiquitinated proteins的表達(dá),western blot及Anexin V/PI觀察凋亡的改變。
　　(9) IFN-γ刺激后WB檢測(cè)正常鼻粘膜上皮細(xì)胞中自噬流的變化：用rapamycin預(yù)先處理上皮細(xì)胞3小時(shí)后，再用IFN-γ刺激，或先IFN-γ刺激上皮細(xì)胞

8、24小時(shí)，于收集細(xì)胞前加入bafilomycin A1刺激3小時(shí)，western blot檢測(cè)自噬流（LC3B, p62）及cleaved PARP的改變；Anexin V/PI檢測(cè)凋亡的改變。
　　(10)轉(zhuǎn)染siNS或sip62, siAtg5到正常鼻粘膜上皮細(xì)胞,再IFN-γ刺激后觀察p62及凋亡的改變：轉(zhuǎn)染20 nMsiNS或sip62,或60 nMsiAtg5到正常鼻粘膜上皮細(xì)胞后,再IFN-γ刺激24小時(shí)，觀察p62蛋

9、白及凋亡的改變。
　　研究結(jié)果：（1）自噬相關(guān)蛋白LC3B-II, Atg3, Atg5, Atg7, Beclin1；自噬底物蛋白p62, ubiquitinated蛋白；溶酶體標(biāo)記物 LAMP-1,以及凋亡相關(guān)蛋白 cleaved caspase-8, caspase-3and PARP在嗜酸粒細(xì)胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細(xì)胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎的組織，及鼻粘膜上皮細(xì)胞中，相較于正常組，均表達(dá)增加。
　

10、?。?）加入自噬抑制劑bafilomycin A1引起鼻息肉上皮細(xì)胞中LC3B-Ⅱ，p62, cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平均升高，而加入自噬激動(dòng)劑rapamycin僅引起LC3B-Ⅱ輕微升高，p62, cleaved PARP相應(yīng)的出現(xiàn)輕微的降低，均相對(duì)于對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在鼻息肉上皮細(xì)胞中自噬是升高的，而且自噬流的通路是無障礙的。
　?。?）用轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染sip62到鼻息肉上皮細(xì)胞中，我們觀察到相應(yīng)的外源性的凋亡

11、通路cleaved caspase8, cleaved PARP的蛋白水平均出現(xiàn)降低。
　　（4）分別用白介素 IL-4, IL-13, IL-17A或 IFN-γ或 dsRNA,或 LPS刺激BEAS-2B細(xì)胞系，篩選出 INF-γ可能是鼻息肉上皮細(xì)胞中自噬不足的上游影響因素。再用INF-γ刺激氣液界面培養(yǎng)的正常原代鼻黏膜上皮細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)與刺激BEAS-2B細(xì)胞系的結(jié)果類似，自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ出現(xiàn)增高；而其底物蛋白p62

12、, ubiquitinated蛋白反而也出現(xiàn)增高。為進(jìn)一步證實(shí)是否存在自噬不足，我們?cè)俅渭尤胱允梢种苿゜afilomycin A1到INF-γ刺激的正常鼻粘膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞中LC3B-Ⅱ，p62, cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平均升高，而加入自噬激動(dòng)劑rapamycin僅引起LC3B-Ⅱ輕微升高，p62, cleaved PARP相應(yīng)的出現(xiàn)輕微的降低，均相對(duì)于對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮細(xì)胞與鼻息肉上

13、皮細(xì)胞出現(xiàn)的自噬不足的狀態(tài)類似。
　?。?）為進(jìn)一步證實(shí) IFN-γ通過 p62蛋白誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，我們分別 sip62或siAtg5到正常鼻粘膜原代上皮細(xì)胞，再用IFN-γ刺激。我們發(fā)現(xiàn)sip62+IFN-γ相較于siNS+IFN-γ，cleaved PARP及capase-8的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而siAtg5后p62表達(dá)上調(diào)，所以siAtg5+IFN-γ相較于siNS+IFN-γ，cleaved PARP及c

14、apase-8的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以在鼻粘膜上皮細(xì)胞中IFN-γ可能通過p62蛋白影響上皮細(xì)胞凋亡。研究結(jié)論：1. IFN-γ在嗜酸粒細(xì)胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細(xì)胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎組織中均表達(dá)增高。而且凋亡在嗜酸粒細(xì)胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細(xì)胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎上皮細(xì)胞中均表達(dá)增高。
　　2.增高的IFN-γ可能通過誘導(dǎo)自噬不足引起 p62蛋白的上調(diào)，進(jìn)而通過增高的p