基于MEA的PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和海馬腦片在鹽酸利多卡因作用下電刺激響應(yīng)特性研究.pdf

1、人類至今對腦的奧秘知之甚少，揭示腦的工作原理是當(dāng)代自然科學(xué)最大的挑戰(zhàn)之一。神經(jīng)元是大腦的基本組成單位，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的信息感知、處理、傳遞機(jī)制是大腦高級活動的基礎(chǔ)。因此，對大腦功能機(jī)制研究的一個有效途徑在于對神經(jīng)元的信號傳遞特性和對外界刺激的響應(yīng)特性進(jìn)行研究。本課題組首次提出了采用電壓閾值測定法評價待測因素對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)電興奮性的影響，該方法具有快速、定量等優(yōu)點，并且課題組前期利用了該方法對溫度、酒精、乙酰膽堿等具有單向變化規(guī)律的外界因素進(jìn)行

2、研究。本論文選用具有雙相作用的鹽酸利多卡因作為研究對象，利用微電極陣列技術(shù)，通過對類神經(jīng)元細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)）和神經(jīng)組織（大鼠海馬腦片）在鹽酸利多卡因作用下電刺激響應(yīng)特性進(jìn)行了初步研究，定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因?qū)C12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和大鼠海馬腦片電興奮性的影響。另外本論文還進(jìn)行了PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在不同濃度鹽酸利多卡因作用下高內(nèi)涵細(xì)胞組學(xué)實驗，并與電壓閾值測定法實驗結(jié)果進(jìn)行對比分析。
　　本論文首先在MEA上培養(yǎng)PC12

3、細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成類神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，通過對不同濃度鹽酸利多卡因作用下PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的電刺激響應(yīng)信號探測實驗，獲得了PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在各個濃度鹽酸利多卡因作用下的電刺激電壓閾值。根據(jù)PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)刺激電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度的變化曲線，定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因?qū)C12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)電興奮性的影響。結(jié)果顯示: PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在鹽酸利多卡因作用下電興奮性的變化具有濃度依賴性。當(dāng)鹽酸利多卡因濃度在0.1～1.2μg/mL之間可抑制PC1

4、2細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)電興奮性，即產(chǎn)生麻醉作用，其麻醉效果先隨濃度增加呈正相關(guān)性，在濃度為0.5μg/mL時達(dá)到最佳麻醉效果，然后隨濃度繼續(xù)增加而呈負(fù)相關(guān)性。而當(dāng)濃度超過1.2μg/mL后鹽酸利多卡因可增強(qiáng)PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)電興奮性，即產(chǎn)生興奮作用。且其興奮作用隨濃度增加而呈正相關(guān)性。但當(dāng)鹽酸利多卡因濃度超過1.5μg/mL后，PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)達(dá)到并維持在較高的興奮狀態(tài)，且僅需最小量(1mV)的電刺激即可持續(xù)爆發(fā)響應(yīng)信號。實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道相近。

5、r>　　然后本論文又制備了12～14天SD大鼠海馬腦片，進(jìn)行了0.1～5μg/mL范圍內(nèi)多個濃度鹽酸利多卡因作用下大鼠海馬腦片的電刺激響應(yīng)信號探測實驗，獲得了大鼠海馬腦片在各個濃度鹽酸利多卡因作用下的電刺激電壓閾值。根據(jù)大鼠海馬腦片電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度的變化曲線，定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因?qū)Υ笫蠛ｑR腦片電興奮性的影響。實驗獲得了與PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)部分、文獻(xiàn)報道相近的結(jié)果，即大鼠海馬腦片在鹽酸利多卡因作用下電興奮性的變化

6、具有濃度依賴性。當(dāng)鹽酸利多卡因濃度在0.1～1.2μg/mL之間可抑制大鼠海馬腦片電興奮性，即產(chǎn)生麻醉作用，且其麻醉效果先隨濃度增加呈正相關(guān)性，在0.6μg/mL時達(dá)到最佳效果，然后隨濃度繼續(xù)增加而呈負(fù)相關(guān)性。而當(dāng)濃度超過1.3μg/mL后鹽酸利多卡因可增強(qiáng)大鼠海馬腦片電興奮性，即產(chǎn)生興奮作用。且在1.3～1.5μg/mL范圍內(nèi)鹽酸利多卡因?qū)Υ笫蠛ｑR腦片的興奮作用隨濃度增加而呈正相關(guān)性。但當(dāng)鹽酸利多卡因濃度超過1.5μg/mL后，大鼠海

7、馬腦片達(dá)到并維持在較高的興奮狀態(tài)，且僅需最小量(1mV)的電刺激即可爆發(fā)響應(yīng)信號。
　　最后采用高內(nèi)涵細(xì)胞組學(xué)分析系統(tǒng)對不同濃度鹽酸利多卡因急性作用后的PC12細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了熒光成像分析。首先采用PI染色方法對凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，分析了0～1.7μg/mL濃度鹽酸利多卡因急性作用15分鐘后PC12細(xì)胞的凋亡程度。實驗結(jié)果顯示，鹽酸利多卡因急性作用后PC12細(xì)胞的PI染色呈陰性，PC12細(xì)胞無凋亡現(xiàn)象，表明此濃度范圍內(nèi)鹽酸利多卡因的急

8、性作用不會導(dǎo)致PC12細(xì)胞凋亡。隨后采用鬼筆環(huán)肽染色方法對PC12細(xì)胞的細(xì)胞骨架進(jìn)行標(biāo)記，分析了0～1.7μg/mL濃度鹽酸利多卡因急性作用15分鐘后PC12細(xì)胞的突起長度、面積的變化。結(jié)果顯示，實驗組與對照組中每個細(xì)胞的平均突起長度、面積具有明顯差別。鹽酸利多卡因急性作用后PC12細(xì)胞的平均每個細(xì)胞突起長度、面積具有濃度依賴性，其變化規(guī)律與電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度變化的規(guī)律一致，從細(xì)胞組學(xué)角度（突起特性）驗證了電壓閾值法的結(jié)果