一氧化氮(NO)對肌損傷炎癥反應的干擾效應.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一章 Notexin誘導的急性肌損傷及損傷肌組織NO水平檢測
　　目的：
　　Notexin肌內(nèi)注射誘導急性骨骼肌損傷，分析損傷肌組織的潰變、炎性滲出、再生特性;檢測并對比分析NO的拮抗劑(L-NAME)/供體(SNP)處理前、后損傷肌組織內(nèi)NO濃度、NOS水平改變。
　　方法：
　　清潔級雌性C57BL/6小鼠(4-8w)常規(guī)飼養(yǎng)，脛骨前肌(tibialis ant

2、errior，TA)注射notexin(0.1 mg/kg)，分別于0d，4d，7d，10d摘取小鼠TA，冰凍切片，H&E及Dystrophin免疫熒光染色。分別于Notexin注射后第1、第4天腹腔注射L-NAME(100 mg/kg)和SNP(0.5 mg/kg)，分別于notexin注射后第4天和第7天摘取TA，提取總RNA，Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，經(jīng)特定引物(eNOS，iNOS，nNOS) PCR擴增;組織勻漿后測

3、定NO濃度。結果用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異有統(tǒng)計學意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　HE及Dystrophin熒光染色表明，notexin注射4天時，可見大量的肌纖維壞死及炎性滲出，7天時壞死區(qū)被擁有中央核的再生肌纖維替代。10天時肌纖維的再生基本完成。Notexin注射后4天，小鼠肌組織中NO濃度較

4、對照組顯著上調(diào)（P＜0.05，n=3）;SNP處理后肌組織NO濃度較之單獨損傷組進一步升高(P＜0.05，n=3);反之，L-NAME處理會下調(diào)肌內(nèi)NO水平。qPCR結果表明，L-NAME能誘導損傷的TA肌內(nèi)eNOS，iNOS，nNOS基因表達下調(diào)（與單純的損傷組比較，P＜0.05，n=3），尤以iNOS下調(diào)最為顯著。SNP處理不影響NOS基因表達。
　　結論：
　　Notexin肌內(nèi)注射能誘發(fā)骨骼肌的壞死及炎性滲出。由于n

5、otexin誘發(fā)的骨骼肌壞死于傷后4天最為廣泛，7天后再生的肌纖維完全替代潰變組織，因此我們分別選取4天和7天作為壞死、再生的取材時間點。急性肌損傷后，NOS以及肌源性NO濃度快速上調(diào)。SNP能進一步上調(diào)損傷肌組織NO濃度，L-NAME則下調(diào)肌內(nèi)NO濃度。L-NAME能抑制肌內(nèi)NOS基因的表達，尤其抑制iNOS基因水平。
　　第二章 NO對損傷骨骼肌炎癥反應的干擾效應
　　目的：
　　體內(nèi)干擾NO水平（NO供體SNP，

6、或拮抗劑L-NAME腹腔注射）。分析損傷TA肌組織內(nèi)自身抗原（Mi-2、HARS、DNA-PKcs、Ku-70）、TLRs(TLR3和TLR7)表達改變，肌內(nèi)淋巴細胞的滲出特性及凋亡改變，肌內(nèi)細胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10)和趨化因子(MIP-1α、MCP-1、MCP-3)的水平改變。通過上述研究，明確體內(nèi)NO濃度改變是否影響急性損傷的骨骼肌組織炎性反應。
　　方法：
　　TA肌內(nèi)注射notexin(

7、0.1 mg/kg)，肌損傷后第2天腹腔注射L-NAME(100mg/kg)或SNP(0.5 mg/kg)，7天取材的動物于損傷后第4天再次腹腔注射L-NAME或SNP。分別于損傷后第4天、7天摘取小鼠TA肌，提取肌組織總RNA，Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，引物PCR擴增檢測自身抗原、TLRs、細胞因子（TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10）和趨化因子(MIP-1α、MCP-1、MCP-3);提取TA肌總蛋白，SDS/

8、PAGE電泳分離轉(zhuǎn)膜，ECL化學發(fā)光法檢測自身抗原、TLRs的蛋白表達;TA肌冰凍切片，免疫熒光檢測肌內(nèi)滲出的CD11b、F4/80、CD3/CD8、MHC-Ⅰ(H-2Kb)、caspase-3陽性細胞。組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異有統(tǒng)計學意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　Notexin注射4天時，TA肌內(nèi)自身抗原（Mi-2、HRS和K

9、u-70）和TLR3的mRNA及蛋白水平顯著上調(diào)。L-NAME處理進一步上調(diào)自身抗原和TLR3的表達水平，但SNP處理則下調(diào)上述分子水平。H&E染色及免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，損傷4天時，肌纖維廣泛壞死崩解，可見大量的炎性細胞滲出，滲出細胞多為單核細胞/巨噬細胞(CD11b+，F(xiàn)4/80+)。7天時，仍可見少量滲出的單核/巨噬細胞，Dystrophine陽性的再生肌纖維大量出現(xiàn)。熒光圖像定量分析表明，肌損傷4天時CD11b，或F4/80的平均熒

10、光強度顯著增高，7天時下降，但仍高于正常肌組織。L-NAME處理組4天和7天時CD11b或F4/80的平均熒光強度均顯著高于單純損傷組，SNP處理則降低炎性細胞的熒光強度值。對CD11b+ caspase-3+細胞的觀察和計數(shù)均支持SNP處理促進單核細胞凋亡。qPCR結果表明，Notexin注射誘導損傷肌內(nèi)TGF-β（4d和7d）和IL-10(4d) mRNA水平升高，但L-NAME和SNP不影響上述分子表達。4d和7d時均可見，SNP

11、顯著下調(diào)TNF-α和IL-6、MIP-1α，MCP-1，和MCP-3 mRNA水平，L-NAME的作用相反，上調(diào)TNF-α、IL-6、MIP-1α，MCP-1，和MCP-3 mRNA水平。肌損傷4天時，我們未觀察到CD3ε+CD8α+細胞，以及H-2K b+肌纖維。7d時，肌間隙內(nèi)可見少量CD8α+T細胞和H-2Kb+肌纖維。我們發(fā)現(xiàn)，L-NAME處理后，CD8α+T細胞和H-2Kb+肌纖維的數(shù)量顯著增加。
　　結論：
　　

12、骨骼肌損傷后上調(diào)的肌源性NO干擾肌內(nèi)炎癥反應，抑制骨骼肌自身抗原(Mi-2、HRS、Ku-70)和TLR3的表達，減少單核/巨噬細胞滲出，促進炎性細胞凋亡。同時，NO參與下調(diào)肌內(nèi)的促炎因子和趨化因子，并可能抑制損傷肌組織內(nèi)再生肌纖維MHC-Ⅰ分子的表達及CD8α+T細胞的滲出。上述結果表明，NO參與下調(diào)骨骼肌損傷性炎癥反應。
　　第三章 NO對體外炎性培養(yǎng)的成肌細胞/分化肌管免疫特性的干擾作用
　　目的：
　　分析炎性

13、環(huán)境（IFN-γ刺激）能否誘導C2C12成肌細胞/分化肌管表達MHC分子及活化的NLRP3炎癥小體、明確NO是否干擾C2C12細胞內(nèi)炎癥小體的活化。
　　方法：
　　復蘇凍存的C2C12細胞，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中以1×105/mL密度接種于6孔板貼壁增殖培養(yǎng)，或采用2％馬血清分化培養(yǎng)。分別添加IFN-γ(0.6ug/ml)至增殖、或分化培養(yǎng)的C2C12細胞。采用L-NAME(2.7ug/ml)及SNP(8.94ug/ml

14、)處理IFN-γ干擾48h的分化細胞。分別于IFN-γ刺激后24h、48h，或L-NAME及SNP處理分化細胞6h后收集細胞、提取總RNA及總蛋白，qPCR和Western blot檢測MHC-Ⅰ(H-2Kb)、MHC-Ⅱ、ASC，NLRP3，caspase-1。ELISA技術檢測上述C2C12細胞培養(yǎng)基上清中IL-1β蛋白濃度。結果用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異有統(tǒng)計

15、學意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義
　　結果：
　　IFN-γ刺激培養(yǎng)后，增殖的成肌細胞和分化肌管均顯著上調(diào)MHC-Ⅰ mRNA及蛋白水平，并表達MHC-Ⅱ。qPCR、免疫熒光、免疫印跡檢測均證實，IFN-γ誘導成肌細胞/分化肌管上調(diào)NLRP3、ASC和mature-caspase-1表達水平。ELISA分析進一步證實，較之未刺激的細胞，IFN-γ誘導會顯著上調(diào)C2C12細胞培養(yǎng)基中的IL

16、-1β濃度。SNP處理后6h，分化肌管（IFN-γ刺激48h）內(nèi)炎癥小體(ASC，NLRP3，caspase-1)mRNA和蛋白水平較單純刺激細胞顯著下調(diào)，L-NAME則上調(diào)ASC，NLRP3，caspase-1表達水平。與上述結果一致，SNP和L-NAME處理同時下調(diào)、或上調(diào)培養(yǎng)基中IL-1β濃度。
　　結論：
　　炎性刺激可誘導成肌細胞/再生肌纖維（肌管）成為兼職的APC細胞，并表達MHC分子。表達MHC分子的成肌細胞/