大豆硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmSULTR12b啟動(dòng)子的克隆、功能分析及酵母單雜交初步篩選.pdf

1、硫是繼氮、磷、鉀之后第四大植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。外界環(huán)境中的SO42-通過植物根系進(jìn)入植物體內(nèi)進(jìn)行還原同化作用，生成一系列重要含硫化學(xué)物質(zhì)。這些含硫有機(jī)化合物參與植物體內(nèi)重要的生理生化反應(yīng)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及抵御環(huán)境脅迫起重要作用。SO42-的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)是硫進(jìn)入還原同化途徑中的第一步，也是硫營(yíng)養(yǎng)代謝的主要調(diào)控途徑之一。植物體內(nèi)硫酸根（SO42-）的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)必需借助于硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sulfate transporter，SULTR)。硫

2、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與根系對(duì)外界環(huán)境中硫酸根(SO42-)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。大豆(Glycine max(L.) Merr.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，為人類提供豐富的植物性蛋白。大豆蛋白氨基酸組分齊全，但是大豆的含硫氨基酸（Cys和Met）含量很低，限制了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。對(duì)GmSultr1;2b基因功能研究表明，該基因具有硫轉(zhuǎn)運(yùn)活性，且在根里特異表達(dá)，能夠受到低硫的誘導(dǎo)。在這里，我們希望通過研究GmSultr1;2b基因的啟動(dòng)子的功能，了解GmSultr1

3、;2b基因調(diào)控機(jī)制;通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)找出與GmSultr1;2b啟動(dòng)子互作的蛋白，找到硫代謝及其調(diào)控的分子機(jī)制，通過基因工程的方法調(diào)節(jié)硫代謝途徑中SO42-的分布，為提高含硫氨基酸含量提供理論依據(jù)。
　　本研究利用NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中GmSultr1;2b基因序列信息，選取其上游2259bp序列作為候選啟動(dòng)子。通過在線預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子的調(diào)控元件發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子具有真核生物啟動(dòng)子必須的核心元件TATA-box外，還含有激

4、素應(yīng)答元件ERE（乙烯響應(yīng)元件）、ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）等，脅迫應(yīng)答元件TC-rich repeats（干旱脅迫以及病蟲害脅迫），AT-rich element（AT-rich的DNA與蛋白結(jié)合位點(diǎn)）和MYB等。
　　利用PCR擴(kuò)增得到啟動(dòng)子片段，并構(gòu)建一系列表達(dá)載體。利用大豆瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，大豆瞬時(shí)表達(dá)后進(jìn)行X-gluc染色，結(jié)果顯示重組載體侵染的大豆顯藍(lán)色，說明GmSULTR1;2b啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)下游GUS的

5、表達(dá)。通過5'端和3'端刪除分析實(shí)驗(yàn)證明預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子的TSS位點(diǎn)正確。
　　將重組載體p2179+69∷ GUS以及35S∷ GUS轉(zhuǎn)化大豆，對(duì)轉(zhuǎn)化的大豆毛狀根染色之后，體視鏡下觀察陽(yáng)性根的橫切面，發(fā)現(xiàn)GUS主要在根毛、根表皮和中柱內(nèi)表達(dá)，表明GmSULTR1;2b啟動(dòng)子主要在根毛、根表皮和中柱內(nèi)表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)化的大豆毛狀根進(jìn)行硫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示低硫條件下GUS染色加深。為了定量檢測(cè)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性，對(duì)轉(zhuǎn)化的毛狀根以及硫誘導(dǎo)后的毛狀

6、根進(jìn)行GUS酶活試驗(yàn)(GUSactivity），從結(jié)果可以看出GmSULTR1;2b啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性比CaMV35S啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性弱，硫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，該啟動(dòng)子在低硫條件下其GUS活性比其在高硫條件下活性高，說明該啟動(dòng)子能夠響應(yīng)低硫誘導(dǎo)，這和GmSULTR1;2b基因的表達(dá)情況一致，暗示該啟動(dòng)子屬于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，我們找出幾個(gè)可能與GmSULTR1;2b啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子，這為進(jìn)一步了解硫調(diào)控指出方向，也為后期的進(jìn)一