槲皮素抑制P38 MAPK通路介導(dǎo)的糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)病變的作用機(jī)制.pdf

1、糖尿病(DiabetesMellitus，DM)具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療花費(fèi)等三大特征。其中的高致殘率主要包括糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy，DR)。DR的發(fā)生發(fā)展不但與血漿葡萄糖水平相關(guān)，還與患病時(shí)間密切相關(guān)。越來(lái)越多的研究證實(shí)，在糖尿病早期，視網(wǎng)膜就存在著兩種特征性的病理改變：血-視網(wǎng)膜屏障破壞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。兩者共同演繹著DR早期的演變。 作為一種強(qiáng)力的血管滲漏因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(v

2、ascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在糖尿病視網(wǎng)膜血管病變中起著關(guān)鍵的作用，它介導(dǎo)著糖尿病早期血-視網(wǎng)膜屏障(Blood-RetinalBarrier)的破壞。 Caspase依賴性和Caspase非依賴性凋亡途徑是各種原因所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的兩種基本途徑。糖尿病介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑也應(yīng)該如此。但目前大多數(shù)DR神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究集中在Caspase依賴性凋亡途徑上，而對(duì)Caspase非

3、依賴性凋亡途徑的研究甚少。如果能夠明確哪種凋亡途徑在糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中占主導(dǎo)作用，將有助于視網(wǎng)膜早期更有效的神經(jīng)保護(hù)。 氧化應(yīng)激(oxidativestress，OS)與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?？寡趸瘎┲委熖悄虿〖捌洳l(fā)癥是目前研究的熱點(diǎn)。中草藥是具有很大潛力的天然抗氧化劑資源。在中草藥的抗氧化成分中，黃酮類(lèi)因具有純天然、活性高等特點(diǎn)而備受關(guān)注。槲皮素是黃酮類(lèi)中分布最廣、抗氧化能力最強(qiáng)的一種天然藥物。

4、 絲裂素活化蛋白激酶通路(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)作為氧化應(yīng)激的下游目標(biāo)，具有將氧化應(yīng)激信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)的作用。在高糖環(huán)境的體外實(shí)驗(yàn)研究中，P38MAPK活性增強(qiáng)能夠誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙。如果在糖尿病早期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，存在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的P38MAPK信號(hào)通路調(diào)控視網(wǎng)膜病變，那么局部的抗氧化劑治療也許能夠?qū)μ悄虿≡缙谘?視網(wǎng)膜屏障和神經(jīng)細(xì)胞起著保護(hù)作用。本課

5、題將對(duì)上述問(wèn)題分三個(gè)部分展開(kāi)實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分糖尿病鼠早期VEGF介導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障破壞和easpase依賴的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察糖尿病鼠早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的方式；探討糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑。 方法： 制作鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病雄性Wistar大鼠。1、應(yīng)用IgG血管外滲漏評(píng)估BRB功能的破壞；2、采用

6、TUNEL法、Caspase-3和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducingfactor,AIF)免疫熒光染色法定量視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡；3、利用RT-PCR、Westernblot和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜上VEGF、Caspase-3和AIF的基因、蛋白表達(dá)和分布；4、通過(guò)玻璃體腔注射2μL(4μg)的Caspase-3抑制劑DEVD-CHO，進(jìn)一步明確糖尿病鼠早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<

7、0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異判定標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 糖尿病鼠2周，視網(wǎng)膜出現(xiàn)以IgG血管外滲漏為示蹤物的BRB破壞，4周最為明顯，8周開(kāi)始有所減輕，但均明顯強(qiáng)于年齡匹配的正常對(duì)照組(P<0.01)。VEGF基因和蛋白的表達(dá)以及在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層的分布也在糖尿病2周開(kāi)始出現(xiàn)異常。其中基因表達(dá)2周出現(xiàn)高峰，蛋白和熒光表達(dá)4周最明顯，8周開(kāi)始減輕。雖然視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層厚度和年齡匹配的正常對(duì)照組無(wú)明顯的差異(P>0

8、.05)，但是視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡在2、4、8周均有明顯增加(P<0.01)。另外，Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)以及在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層的分布在糖尿病2周開(kāi)始出現(xiàn)異常。其中基因表達(dá)2周出現(xiàn)高峰，蛋白和熒光表達(dá)4周最明顯，8周開(kāi)始有所減輕，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)。AIF基因表達(dá)在觀察時(shí)間內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到。CaspaSe-3抑制劑DEVD-CHO的玻璃體腔注藥通過(guò)抑制Caspase-3的表達(dá)而降低了視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞

9、的凋亡。 結(jié)論： STZ誘導(dǎo)的糖尿病Wister大鼠早期，出現(xiàn)了VEGF介導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。其中節(jié)細(xì)胞凋亡是以Caspases依賴性凋亡途徑為主。糖尿病早期視網(wǎng)膜的病變可能是一種應(yīng)激過(guò)程。 第二部分糖尿病鼠早期氧化應(yīng)激誘導(dǎo)P38MAPK信號(hào)通路調(diào)控血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制 目的：探討氧化應(yīng)激導(dǎo)致糖尿病早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑及其

10、發(fā)生機(jī)制。 方法： 制作STZ誘導(dǎo)的糖尿病雄性Wistar大鼠。1、通過(guò)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipidperoxidation，LPO)和還原型谷胱甘肽(Glutathioneperoxidase，GSH)的蛋白含量，了解糖尿病早期氧化應(yīng)激在視網(wǎng)膜病變中的作用；2、利用RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜上P38MAPK的表達(dá)；3、玻璃體腔注射2μL(3.77μg)的P38MAPK抑制劑SB203

11、5802周和6周后，以IgG血管外滲漏為示蹤物的BRB功能破壞和Caspase-3介導(dǎo)的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的改變，明確P38MAPK誘導(dǎo)糖尿病早期視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異判定標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 從糖尿病鼠2周開(kāi)始，視網(wǎng)膜組織中LPO蛋白含量顯著升高(P<0.01)，GSH蛋白含量明顯下降(P<0.01)。活性P38MAPK基因和蛋白的表達(dá)在糖尿病2周開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng)，4周

12、表達(dá)最明顯，8周有所減弱，但均明顯強(qiáng)于年齡匹配的正常對(duì)照組(P<0.01)。P38MAPK抑制劑SB203580玻璃體腔注藥2周和6周后，視網(wǎng)膜上VEGF和Caspase-3的免疫熒光表達(dá)均明顯減弱(P<0.01)。以IgG血管外滲漏為示蹤物的BRB破壞均顯著減輕(P<0.01)，TUNEL-陽(yáng)性和Caspase-3陽(yáng)性視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡率均明顯下降(P<0.01)。 結(jié)論： 糖尿病鼠早期存在著氧化應(yīng)激對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用，

13、氧化應(yīng)激通過(guò)誘導(dǎo)下游信號(hào)系統(tǒng)P38MAPK通路的激活，導(dǎo)致了糖尿病早期視網(wǎng)膜BRB的破壞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。 第三部分槲皮素抑制糖尿病鼠早期氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討槲皮素玻璃體腔給藥途徑的可行性；明確槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的糖尿病早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 方法： 制作STZ誘導(dǎo)的糖尿病雄性Wistar大鼠。1、通過(guò)對(duì)糖尿病4周大鼠

14、玻璃體腔分別注射劑量為0.02nM、0.2nM、2nM和10nM的槲皮素2μL，檢驗(yàn)不同劑量的槲皮素對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用，確定對(duì)視網(wǎng)膜起保護(hù)作用的最佳劑量；2、檢測(cè)槲皮素玻璃體腔注藥后，視網(wǎng)膜組織中LPO和GSH的蛋白含量，了解槲皮素在視網(wǎng)膜中的抗氧化作用；3、分別檢測(cè)槲皮素玻璃體腔注藥2周和6周后，活性P38MAPK蛋白量的變化、視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色形態(tài)學(xué)的變化、以IgG血管外滲漏為示蹤物的BRB功能破壞的變化、視網(wǎng)膜上VEGF和Ca

15、spase-3免疫熒光表達(dá)的變化，以及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的改變等，明確槲皮素對(duì)糖尿病早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異判定標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 玻璃體腔注射劑量為2nM的槲皮素，對(duì)糖尿病早期視網(wǎng)膜病變的抑制作用最強(qiáng)(P<0.01)，玻璃體腔注射10nM的槲皮素，出現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層細(xì)胞核減少、視網(wǎng)膜水腫以及節(jié)細(xì)胞凋亡增加等毒副作用。玻璃體腔注射2nM

16、槲皮素治療2周和6周后，視網(wǎng)膜組織中LPO蛋白含量均顯著降低(P<0.01)，GSH蛋白含量均明顯升高(P<0.01)；活性P38MAPK蛋白表達(dá)量均明顯下降(P<0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層VEGF和Caspase-3免疫熒光表達(dá)明顯減弱(P<0.01)，IgG血管外滲漏為標(biāo)志的BRB破壞明顯好轉(zhuǎn)(P<0.01)，TUNEL-陽(yáng)性視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01)。 結(jié)論： 玻璃體腔注射槲皮素治療糖尿病