IUGR仔豬腸道黏膜免疫特性及丁酸衍生物對其調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、子宮內(nèi)發(fā)育遲緩在人和豬上都很常見，全球每年出生的嬰兒中約有1300萬為IUGR，在中國，平均每一窩仔豬出生就有1-3頭為IUGR仔豬，發(fā)病率約為15％-20％。IUGR會導致新生仔豬或新生胎兒較高的發(fā)病率和死亡率，甚至最終導致其長期的發(fā)育受損。IUGR給養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類健康都帶來了很大影響。如何從營養(yǎng)學的角度對母豬和IUGR仔豬進行調(diào)控，已經(jīng)引進廣泛關(guān)注。IUGR給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來經(jīng)濟損失的主要原因有兩個:1、IUGR新生仔豬較高的發(fā)病率和死

2、亡率;2、存活下來的IUGR仔豬也會出現(xiàn)生長性能下降、飼料利用率下降和瘦肉率下降等情況。為了更好地制定IUGR仔豬的日糧，減少IUGR帶來的損失，了解IUGR仔豬的生理及其作用機理具有很重要的意義。研究IUGR仔豬及其營養(yǎng)調(diào)控，不僅可以解決養(yǎng)豬生產(chǎn)中的IUGR問題，而且可以作為一種很好的醫(yī)學模型。本試驗以IUGR仔豬為研究對象，研究了IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫特性并探討其分子作用機制;研究了三丁酸甘油酯對哺乳期IUGR仔豬生長和腸道黏

3、膜免疫的調(diào)節(jié)作用;并比較研究了丁酸鈉和三丁酸甘油酯對IUGR斷奶仔豬生長和腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用。
　　1.IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫特性
　　試驗一選取NBW和IUGR新生仔豬各6頭，所有仔豬不喂食初乳，在出生后2-4小時內(nèi)屠宰取樣。測定體重、免疫器官重、小腸重量和長度、腸道形態(tài)、腸道上皮免疫細胞數(shù)量、腸道黏膜中細胞因子和免疫球蛋白含量、腸道黏膜中細胞因子的基因表達。結(jié)果表明，(1) IUGR組仔豬的胸腺、脾臟、腸系膜淋

4、巴結(jié)和腸道的絕對重量降低（P＜0.01），腸道絕對長度減小(P＜0.05)。IUGR新生仔豬的胸腺、脾臟和腸腺膜淋巴結(jié)的相對重量以及單位長度腸道重量顯著低于（P＜0.01）NBW仔豬。但IUGR仔豬的相對小腸長度增加（P＜0.01）。(2)IUGR新生仔豬小腸腸道絨毛更易受損、更短、長短不一，而NBW仔豬小腸腸道絨毛多完整且整齊。IUGR新生仔豬小腸微絨毛比NBW仔豬的更短且更少。此外，在一些IUGR仔豬的腸道中還觀察到自噬體和線粒體腫

5、脹，而這些現(xiàn)象在NBW仔豬腸道中未找見。(3)IUGR新生仔豬小腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度的比值和絨毛表面積降低（P＜0.01），隱窩深度增加（P＜0.05）。IUGR仔豬回腸絨毛高度降低(P＜0.05)，空腸和回腸絨毛表面積減小(P＜0.05)，回腸絨毛隱窩深度（P＜0.01）和絨毛高度與隱窩深度的比值（P＜0.01）增加。(4) IUGR仔豬空腸（P＜0.05）和回腸（P＜0.01）上皮中杯狀細胞數(shù)量顯著降低。IUGR新生仔豬回

6、腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量顯著低于(P＜0.05)NBW仔豬。(5)IUGR新生仔豬小腸黏膜IFN-γ（P＜0.05）含量顯著低于NBW組。IUGR新生仔豬回腸TNF-α的分泌量顯著低于（P＜0.01）NBW仔豬。(6)IUGR新生仔豬空腸IFN-γ基因表達量低于(P＜0.05)NBW組。IUGR新生仔豬回腸黏膜內(nèi)的IL1β（P＜0.05）、IL2(P＜0.01)、IL10（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.01）的基因表達量都顯著低于NB

7、W組?？傊琁UGR新生仔豬小腸黏膜免疫受損，其腸道和腸系膜淋巴結(jié)發(fā)育不良，腸黏膜機械屏障受損，腸黏膜上皮內(nèi)的免疫細胞數(shù)量減少（包括杯狀細胞和淋巴細胞），腸道黏膜分泌細胞因子的能力下降，并且回腸是主要的損傷部位。
　　2.IUGR新生仔豬腸道CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量和分布
　　試驗設(shè)計同試驗一。測定NBW和IUGR新生仔豬血清中中免疫球蛋白和細胞因子水平，血液和脾臟中CD4+和CD8+T淋巴細胞百分數(shù)，胸腺、腸系膜淋

8、巴結(jié)、空腸和回腸中CD4和CD8蛋白及基因表達，回腸黏膜中CD4和CD8蛋白的分布，空腸和回腸中MHC-Ⅱ基因表達及回腸中MHC-Ⅱ蛋白分布。結(jié)果表明，與NBW新生仔豬相比，(1) IUGR新生仔豬血清中IL1β（P＜0.05）、IL2(P＜0.05)、IL4（P=0.085）、IL10(P＜0.05)和TNF-α（P=0.096）的含量降低或有降低的趨勢。(2)IUGR新生仔豬血液和脾臟中CD8+T淋巴細胞百分數(shù)顯著升高（P＜0.05

9、），CD4+T和CD8+T淋巴細胞的比值降低（P＜0.05）。(3)新生仔豬CD4在胸腺中含量最高、腸系膜淋巴結(jié)中稍低、在腸道組織中更低(P＜0.05)。IUGR仔豬胸腺中CD8蛋白的表達量高于（P＜0.05）NBW仔豬，但腸系膜淋巴結(jié)中CD8蛋白的表達量低于（P＜0.05）NBW仔豬。(4) IUGR新生仔豬胸腺中的CD4基因表達量顯著高于（P＜0.05）NBW仔豬。IUGR新生仔豬空腸和回腸的CD4和CD8基因的表達量都顯著低于（P

10、＜0.01）NBW。(5) CD4蛋白主要在NBW和IUGR新生仔豬回腸黏膜的絨毛固有層表達，CD8在回腸絨毛的上皮細胞和固有層中均有表達。CD4主要在細胞核內(nèi)表達，而CD8在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達。(6) IUGR新生仔豬空腸和回腸中MHC-Ⅱ基因的表達量都顯著低于(P＜0.01)NBW新生仔豬。MHC-Ⅱ在NBW仔豬回腸絨毛的固有層大片地表達，但在IUGR的絨毛固有層只是點狀少量表達。總之，IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫受損與其體內(nèi)

11、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群數(shù)量和分布不平衡、腸道抗原遞呈功能減弱有關(guān)。
　　3.IUGR新生仔豬腸道m(xù)iRNA和Notch2/Jagged1信號通路關(guān)鍵因子的表述
　　試驗設(shè)計同試驗一。測定NBW和IUGR新生仔豬胸腺、腸系膜淋巴結(jié)、空腸和回腸中Notch信號通路中關(guān)鍵基因的表達，空腸和回腸Notch信號通路和TLR信號通路關(guān)鍵基因的表達，小腸miRNA的表達，回腸miRNA的表達，回腸Jagged1蛋白的表達，豬的J

12、agged1基因與miRNA靶向作用的PITA評分。結(jié)果表明，與NBW組相比，(1) IUGR組胸腺Delta1基因表達量下降（P＜0.05），空腸中Delta1和Hes1基因基因、空腸和回腸中Jagged1基因表達量升高(P＜0.05)。(2)IUGR仔豬腸道內(nèi)21種miRNA上調(diào)，22種miRNA下調(diào)。qRT-PCR驗證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。IUGR新生仔豬腸道中miR-19a-3p（P＜0.01）、miR-17-5p（P＜0.0

13、5）、miR-199a-5p（P=0.051）、miR-15a(P=0.076)、miR-19a（P＜0.01）和ssc-miR-19b(P＜0.01)都上調(diào)或有上調(diào)趨勢;而miR320(P＜0.01)、miR-181b(P＜0.05)、ssc-miR-151-3p(P=0.050)、ssc-miR-128（P=0.069）和miR-15b（P=0.087）均下調(diào)或有下調(diào)趨勢。(3)IUGR新生仔豬回腸中的miR-19a-3p有上升的趨

14、勢（P=0.071）、miR-19b顯著上升(P＜0.05)、miR-181b顯著下降(P＜0.05)。(4)IUGR新生仔豬回腸中Jagged1蛋白的表達顯著高于(P＜0.05)NBW組。(5)miR-320與Jagged1基因可能存在靶向作用?？傊?，IUGR新生仔豬體內(nèi)CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群數(shù)量和分布不平衡可能與Notch信號通路有關(guān)，且IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫功能受損可能與miRNA參與調(diào)節(jié)Notch2/Jagged

15、1等信號通路關(guān)鍵因子的表達有關(guān)。
　　4.三丁酸甘油酯對IUGR哺乳仔豬腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用
　　試驗選取8頭NBW和16頭IUGR新生仔豬，NBW仔豬為NBW組，IUGR仔豬分為IUGR組和IT組，每組8頭仔豬。所有仔豬自然哺乳至7日齡斷奶。7日齡至21日齡，NBW組和IUGR組飼喂基礎(chǔ)奶粉日糧，IT組飼喂添加了0.1％三丁酸甘油酯的奶粉日糧。21日齡每組選6頭仔豬屠宰取樣。測定所有仔豬在0d、7d、10d、14d、17

16、d和20d的體重，測定腸道消化酶活性、腸道絨毛形態(tài)、腸道黏膜免疫球蛋白水平、腸道IgG、FcRn和GPR41基因水平。結(jié)果表明，(1)IUGR和IT組仔豬的體重在0d、7d、1id和14d的時候都顯著低于（P＜0.05）NBW組，但是在17d和20d時，IT組仔豬的體重顯著高于IUGR組(P＜0.05)，且與NBW組差異不顯著（P＞0.05）。(2) IUGR組仔豬的脾臟重顯著低于(P＜0.05) NBW組，而IT組的脾臟重和相對脾臟重

17、顯著高于(P＜0.05)IUGR組。與NBW組相比，IUGR組仔豬的空腸更薄(P＜0.05)，十二指腸相對長度增加(P＜0.05)，IT組的空腸相對長度低于（P＜0.05）IUGR組，(3) IUGR組仔豬小腸絨毛長短不一， IT和NBW組仔豬小腸絨毛比較整齊。IUGR組仔豬小腸絨毛呈扁平狀，更易受損，而IT和NBW組的小腸絨毛較完整且發(fā)育良好。(4) NBW組的絨毛長度最高，IT組次之，IUGR組最短;IT組的肌層厚度和黏膜厚度最高，

18、NBW組次之，IUGR組最低。此外，三組仔豬十二指腸和空腸絨毛形態(tài)差異顯著。(5)在十二指腸，IUGR組仔豬乳糖酶、蔗糖酶和脂肪酶活性低于(P＜0.05)NBW組，麥芽糖酶活性高于(P＜0.05) NBW組，而IT組仔豬乳糖酶活性顯著高于(P＜0.05) IUGR組。在空腸，與NBW組仔豬相比，IUGR組仔豬胰蛋白酶活性降低（P＜0.05），蔗糖酶活性升高（P＜0.05）;而IT組仔豬胰蛋白酶活性高于(P＜0.05) IUGR組，蔗糖酶

19、活性低于（P＜0.05）IUGR組。在回腸，IUGR仔豬5種消化酶活性均低于（P＜0.05）NBW組，IT組仔豬回腸這5種消化酶活性均高于(P＜0.05)IUGR組(6) IUGR仔豬回腸黏膜sIgA和IgG抗體的含量低于(P＜0.05) NBW組，而IT組仔豬回腸黏膜sIgA和IgG抗體的含量顯著高于（P＜0.05）IUGR組。(7)IUGR仔豬十二指腸、空腸和回腸中IgG基因的表達量都低于（P＜0.05）NBW組，而IT組仔豬回腸中

20、IgG的含量顯著高于（P＜0.05）IUGR組。IUGR組仔豬十二指腸和回腸中GPR41基因表達量低于（P＜0.05）NBW組，而IT組仔豬十二指腸和回腸中GPR41基因表達量顯著高于(P＜0.05)IUGR組?？傊?，三丁酸甘油酯可以提高IUGR哺乳仔豬的日增重、促進其腸道和免疫器官發(fā)育、改善腸道絨毛形態(tài)、提高腸道絨毛表面積和腸道內(nèi)消化酶活性、提高腸道黏膜內(nèi)抗體水平并促進IgG和GPR41基因的表達。
　　5.丁酸鈉和三丁酸甘油酯

21、對IUGR斷奶仔豬腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)作用的比較
　　試驗選取8頭NBW新生仔豬和24頭IUGR新生仔豬。NBW仔豬為NBW組，來自與同一窩的3頭IUGR仔豬被分別分到IUGR組、IS組（IUGR+0.05％丁酸鈉）和IT組（IUGR+0.09％三丁酸甘油酯）。所有仔豬0到21d齡自然哺乳，21d齡斷奶，NBW組和IUGR組飼喂基礎(chǔ)日糧，IS飼喂丁酸鈉日糧（基礎(chǔ)日糧+0.05％丁酸鈉），IT組飼喂三丁酸甘油酯日糧（基礎(chǔ)日糧+0.09％

22、三丁酸甘油酯），直至35d試驗結(jié)束。測定所有仔豬在0d、21d、24d、27d、31d和35d的空腹體重、試驗期仔豬腹瀉率，計算每組每只仔豬平均日采食量、平均日增重和飼料利用率。每組選6頭仔豬屠宰取樣。測定仔豬免疫器官重、腸道長度和重量、腸道絨毛形態(tài)、腸道消化酶活性、腸道黏膜中免疫相關(guān)基因的表達。結(jié)果表明，(1) IUGR、IS和IT組仔豬體重0d、21d、24d和27d時都顯著低于(P＜0.05) NBW組，但31d和34d時，IS組

23、和IT組仔豬的體重與NBW組差異不顯著（P＞0.05）。(2)IUGR組仔豬十二指腸重顯著低于（P＜0.05）NBW組，相對空腸長度顯著高于（P＜0.05）NBW組，IS組十二指腸重和相對空腸重均顯著高于（P＜0.05）IUGR組，IT組的相對十二指腸重顯著低于(P＜0.05)IS組。(3)IUGR組仔豬小腸絨毛形態(tài)指標均不如NBW組，飼喂丁酸鈉或三丁酸甘油酯后，小腸絨毛形態(tài)有不同程度的改善。(4)總體趨勢是，IUGR仔豬小腸消化酶活性

24、低于NBW組，飼喂丁酸鈉或三丁酸甘油酯后，消化酶活性有不同程度的提高。(5)IUGR組小腸黏膜一些部位CD4、CD8、FcRn、GPR41和IgG基因表達低于NBW組。IS組小腸黏膜一些部位CD4、CD8、MHC-Ⅱ、FcRn和IgG基因表達高于IUGR組，IT組小腸黏膜一些部位MHC-Ⅱ、FcRn、IgG和GPR41基因表達均高于(P＜0.05) IUGR組，IT組空腸和回腸CD4基因表達低于(P＜0.05)IS組，十二指腸IgG基因

25、表達高于（P＜0.05）IS組，空腸IgG基因和十二指腸GPR41基因高于（P＜0.05）IS組?？傊跀嗄虝r，給IUGR仔豬補飼丁酸鈉或三丁酸甘油酯均可以從一定程度上提高其生長性能和增強其腸道黏膜免疫功能，且丁酸鈉效果略優(yōu)于三丁酸甘油酯。
　　總之，通過以上五部分試驗內(nèi)容，我們研究了IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫的特性，發(fā)現(xiàn)其腸道黏膜免疫受損，腸道黏膜細胞因子分泌功能減弱;我們懷疑這與其腸黏膜內(nèi)免疫細胞數(shù)量的減少，尤其是T淋巴細

26、胞數(shù)量的減少有關(guān)，于是，進一步研究了IUGR新生仔豬體內(nèi)中CD4+和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量和分布，發(fā)現(xiàn)IUGR新生仔豬體內(nèi)T淋巴細胞亞群失衡，腸黏膜抗原遞呈功能受損;于是，我們進一步探討了其分子機制，研究了IUGR新生仔豬腸道內(nèi)miRNA和Notch2/Jagged1信號通路關(guān)鍵因子的表達，篩選出了NBW和IUGR仔豬小腸中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫功能受損可能與miRNA參與調(diào)節(jié)Notch2/Jagged