偽狂犬病毒pUL37、VP16、VP22單抗制備及免疫電鏡方法的建立.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的可感染多種哺乳動(dòng)物的急性傳染病。豬是PRV的自然宿主，感染可造成懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，新生仔豬急性死亡。PRV屬于皰疹病毒科，具有皰疹病毒粒子的典型結(jié)構(gòu)，其中，被膜層是一個(gè)復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)，位于衣殼和囊膜之間。由UL37、UL48、UL49基因分別編碼的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒復(fù)制及裝配中執(zhí)行著不

2、同的生物學(xué)功能，研究這些蛋白的功能對(duì)新的抗病毒靶點(diǎn)篩選具有重要意義。然而，對(duì)這些蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定位的方法還沒(méi)有建立起來(lái)。
　　本研究，首先將UL49、UL48、UL37基因分別克隆到真核表達(dá)載體pCAGGS，并采用KCl染色切膠法純化原核表達(dá)的蛋白。分別用真核質(zhì)粒和純化的蛋白作為抗原，對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行3次免疫。通過(guò)細(xì)胞融合及單抗特性鑒定試驗(yàn)獲得1株穩(wěn)定分泌VP22蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株3D6;2株穩(wěn)定分泌VP16蛋白單抗的雜

3、交瘤細(xì)胞株1D4、4B6;3株穩(wěn)定分泌pUL37蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株1E2、2G2、11C3。間接免疫熒光(ⅢA)和Western-blot試驗(yàn)表明，抗體株均可與相應(yīng)蛋白特異性結(jié)合;經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定，單抗亞類均為IgMκ;ELISA檢測(cè)單抗的效價(jià)，1D4為1∶8000，11C3為1∶6000，3D6為1∶3000，4B6為1∶4000，1E2、2G2為1∶32000。
　　測(cè)定PRV分離株HLJ-2013的病毒滴度，并將其(

4、0.1MOI)接種于易感性細(xì)胞PK15，16h后收集細(xì)胞并制備免疫標(biāo)記用超薄切片。將以上實(shí)驗(yàn)獲得的單克隆抗體進(jìn)行1∶50，1∶100，1∶200稀釋作為一抗，商品化抗鼠金標(biāo)抗體1∶100倍稀釋作為二抗，進(jìn)行感染細(xì)胞內(nèi)偽狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫標(biāo)記和電鏡檢測(cè)。通過(guò)對(duì)免疫電鏡結(jié)果的分析，篩選出在亞細(xì)胞水平結(jié)合特異性強(qiáng)的單克隆抗體株:3D6、1D4、1E2，其最佳稀釋比例分別為:1∶100、1∶100、1∶200。