糖基化對畢赤酵母表達(dá)的β--葡萄糖苷酶Bgl3A的酶學(xué)性質(zhì)影響.pdf

1、糖基化修飾是生物體內(nèi)最常見的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，可以影響蛋白分泌、穩(wěn)定性，以及免疫原性等生物學(xué)功能。自然界中真核微生物分泌大量糖苷水解酶用于降解植物多糖。這些糖苷水解酶經(jīng)常發(fā)生N/O-糖基化修飾，從而影響酶的活性和穩(wěn)定性。本論文中以來源于嗜熱真菌籃狀菌（Talaromyce leycettanus JCM12802）的β-葡萄糖苷酶bgl3A為研究材料，比較了該基因在三種真核表達(dá)系統(tǒng)（籃狀菌，畢赤酵母和腐質(zhì)霉）和一種原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸

2、桿菌）中不同程度糖基化修飾對酶學(xué)性質(zhì)的影響。通過N/O-糖基化單點(diǎn)突變和畢赤酵母表達(dá)，初步分析了不同位點(diǎn)，不同類型糖基化修飾對酶的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)四種重組Bgl3A的酶學(xué)性質(zhì)比較
　　β-葡萄糖苷酶Bg13A分別在四種系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化成單一蛋白。SDS-PAGE分析表明不同真核系統(tǒng)表達(dá)的重組Bgl3A存在不同程度的N-糖基化修飾和O-糖基化修飾，其中腐質(zhì)霉表達(dá)系統(tǒng)中的糖基化修飾程度低于其他兩種真核表達(dá)

3、系統(tǒng)。酶學(xué)性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)不同表達(dá)系統(tǒng)來源的重組Bgl3A性質(zhì)差異較大，如pH穩(wěn)定性（籃狀菌＞大腸桿菌＞腐質(zhì)霉＞畢赤酵母）、纖維二糖催化效率（腐質(zhì)霉，91s-1mM-1＞畢赤酵母，89s-1mM-1＞籃狀菌，27s-1mM-1＞大腸桿菌，12s-1mM-1）。結(jié)果表明不同系統(tǒng)表達(dá)酶蛋白存在不同程度的糖基化后修飾，這些糖基化后修飾對酶蛋白的性質(zhì)有一定影響。
　　(2)N-糖基化對β-葡萄糖苷酶Bgl3A酶學(xué)性質(zhì)的影響
　　通過定點(diǎn)

4、突變構(gòu)建N-糖基化突變體并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。突變體S228A分泌蛋白產(chǎn)量極低，僅能微量檢測到酶活力;突變體T44A和S299A的最適pH和溫度沒有改變，但二者的Tm值和70℃下的熱穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于野生型。以纖維二糖為底物時(shí)，突變體T44A和S299A的催化效率基本不變。由此可知，N-糖基化主要影響B(tài)gl3A的分泌和熱穩(wěn)定性，其中N226位點(diǎn)的N-糖基化在酶的折疊和分泌中起重要作用，且不同位點(diǎn)的N-糖基化修飾因其結(jié)構(gòu)上的差異而導(dǎo)致了酶學(xué)性

5、質(zhì)的豐富性。
　　(3)O-糖基化對β-葡萄糖苷酶Bgl3A酶學(xué)性質(zhì)的影響
　　同時(shí)構(gòu)建O-糖基化突變體。與野生型相比，突變體的最適溫度和pH均沒有發(fā)生明顯變化，但不同程度地拓寬了Bgl3A的pH穩(wěn)定性，即T443A＞T436A＞T437A＞W(wǎng)T。酶促反應(yīng)動力學(xué)分析表明T443A對兩種底物的催化能力明顯降低，而突變體T436A和T437A對纖維二糖的催化效率具有一定的提高。結(jié)果表明T443位點(diǎn)的O-糖基化對維持Bgl3A的活

6、性起到關(guān)鍵作用，而T436和T437位點(diǎn)的O-糖基化有可能影響到Bgl3A的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對催化效率起到一定作用。由于糖鏈與緩沖液相互作用，O-糖基化對Bgl3A的pH穩(wěn)定性起到重要作用。
　　本論文通過比較四種系統(tǒng)表達(dá)β-葡萄糖苷酶Bgl3A的酶學(xué)性質(zhì)，初步得出不同糖基化對Bgl3A的性質(zhì)影響不一。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，構(gòu)建不同類型糖基化突變體并比較酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果可知N-糖基化主要影響B(tài)gl3A的催化效率，O-糖基化主要影響B(tài)g