可吸入溫石棉纖維通過(guò)ROS-JNK通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：(1)觀察可吸入溫石棉纖維對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制和凋亡作用;(2)觀察可吸入溫石棉纖維作用A549細(xì)胞過(guò)程，活性氧(reactive oxygen species，ROS)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase，JNK)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;(3)觀察可吸入溫石棉纖維作用A549細(xì)胞過(guò)程ROS與JNK通路之間的相互作用，進(jìn)一步探索溫石棉誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。
　　方法：(1)篩選可吸入溫

2、石棉纖維作用時(shí)間和濃度：以A549細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,不同濃度的溫石棉(12.5、25、50、100、200μg/mL)分別作用A549細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、48h)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;(2)觀察A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：不同濃度的溫石棉(50、100、200μg/mL)分別作用A549細(xì)胞24h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，使用Hoechst33258試劑染色，熒光顯微鏡下觀察并記錄;(3)探索ROS、JNK通

3、路對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響及兩者之間的關(guān)系：不同濃度的溫石棉(50、100、200μg/mL)分別作用A549細(xì)胞24h，并設(shè)置陰性對(duì)照組、JNK抑制組（SP600125干預(yù)）、ROS抑制組(NAC干預(yù))，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法分析各組的細(xì)胞凋亡率;JC-1熒光探針?lè)z測(cè)各組線(xiàn)粒體膜電位的下降程度;PI染色檢測(cè)各組細(xì)胞周期的分布變化;DCFH-DA熒光探針負(fù)載法檢測(cè)各組ROS產(chǎn)生水平;Western blot檢測(cè)p-JN

4、K蛋白、JNK蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：(1)可吸入溫石棉纖維可抑制A549細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)濃度、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系：與陰性對(duì)照組比較，溫石棉作用細(xì)胞12h時(shí)，溫石綿組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)下降(P＜0.05);溫石棉作用細(xì)胞48h時(shí)，細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.01)，其中以100、200μg/mL溫石棉組細(xì)胞存活率下降最為明顯;溫石棉作用A549細(xì)胞24h后，以50、100、200μg/mL溫石棉組細(xì)

5、胞存活率分別為（74.86±6.95）％、（70.04±6.52）％、（59.78±5.18）％，為方便觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇濃度為50、100、200μg/mL的可吸入溫石棉纖維作用A549細(xì)胞24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)與陰性對(duì)照組相比，不同濃度溫石棉作用A549細(xì)胞后，細(xì)胞整體熒光強(qiáng)度增加，出現(xiàn)較多皺縮濃染的亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞。細(xì)胞間隙增大，形態(tài)縮小、變圓，有的呈空泡狀改變，有的可見(jiàn)胞核濃染，甚至可見(jiàn)較多碎裂的凋亡小體以及馬蹄形（新月形）胞

6、核形態(tài)改變。(3)50、100、200μgfmL溫石棉組細(xì)胞凋亡率分別為（23.05±3.44）％、（31.67±1.55）％、（64.04±2.78）％，同時(shí)伴有ROS水平增高、線(xiàn)粒體膜電位下降、p-JNK蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)增加，細(xì)胞周期停滯在G2/M期。(4)抑制JNK通路后，p-JNK蛋白的表達(dá)下降(P＜0.05)，溫石棉濃度為50、100、200μg/mL的JNK抑制組凋亡率分別為（16.28±1

7、.83）％、(25.20±3.11)％、（52.82±4.57）％，線(xiàn)粒體膜電位的下降、cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的增加受抑制(P＜0.05)。(5)當(dāng)溫石棉濃度為50、100μg/mL時(shí)，抑制JNK通路對(duì)細(xì)胞周期改變無(wú)明顯作用(P＞0.05);溫石棉濃度為200μg/mL時(shí)，抑制JNK通路能改善細(xì)胞的G2/M期停滯(P＜0.05)。(6)當(dāng)溫石棉濃度為50、100μg/mL時(shí)，抑制JNK通路不能抑制ROS的產(chǎn)生(P＞0。

8、05);溫石棉組濃度為200μg/mL時(shí)，抑制JNK通路能減少ROS的產(chǎn)生(P＜0.05)。(7)抑制ROS產(chǎn)生后，ROS產(chǎn)生水平下降，溫石棉濃度為50、100、200μg/mL的ROS抑制組凋亡率分別為（12.26±0.97）％、（20.52±1.82）％、(47.38±2.94)％，線(xiàn)粒體膜電位下降受抑制，細(xì)胞G2/M期停滯有改善，p-JNK蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：(1