深海來源無活性野生株雜色曲霉ZBY-3的活性突變株篩選與突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物研究.pdf

1、在特殊生境下提取的微生物活性產(chǎn)物研究中，在篩選得到能夠產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的微生物過程中，僅有少量的微生物菌株能產(chǎn)生相應的活性，并可以直接應用于次級代謝產(chǎn)物的研究，而絕大多數(shù)菌株則在相應的篩選模型中沒有表現(xiàn)出相應的活性。如何改造這些無活性菌株的次級代謝功能，進而使其有效地轉化為活性菌株，并產(chǎn)生相應的活性次級代謝產(chǎn)物，是本課題所需要研究的重點。核糖體工程及其相關的抗生素抗性篩選技術已被成功地應用在了調控原核微生物領域微生物的次級代謝功能改

2、造上，而通過氨基糖苷類抗生素抗性篩選將無活性真菌野生株轉化成活性突變株，僅在本課題組前期工作中，探索性地應用在特殊生境的潮間帶真菌產(chǎn)紫青霉G59上，本研究在此基礎之上，將抗生素抗性導入真菌細胞的技術應用到另一株深海來源的無活性野生真菌，使其發(fā)生活性化轉化，得到穩(wěn)定的具有活性的抗性突變株，通過抗性驗證，證明其抗性被穩(wěn)定的導入，再通過發(fā)酵分離得到新產(chǎn)活性化合物并驗證之，最終闡明了突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究。
　　本論文以從采集于174.

3、2130°E，24.3444°S(南太平洋斐濟周邊大洋)，水深800米處海泥中提取的無活性真菌ZBY-3，經(jīng)分類學研究鑒定該菌株為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)。采用DMSO與超聲介導下的不同濃度的新霉素抗性篩選方法獲取突變株，并對突變株進行了抗細菌、抗腫瘤活性篩選。在此基礎上對其中1株活性突變株進行了新產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究。
　　分離得到雜色曲霉ZBY-3，采用MTT法，以人白血病K562細胞為受試細胞，經(jīng)

4、初篩和復篩，在100μg/mL樣品濃度下沒有抗腫瘤作用。這一株無活性菌株則為探索二次開發(fā)無活性菌株的相關研究提供了有效的原始菌株。
　　采用超聲、DMSO不同的介導方法，對含有不同濃度新霉素的孢子懸液進行處理，結果證實DMSO介導新霉素的抗性篩選方法能獲取突變株。通過對菌懸液處理時間、DMSO體積濃度比、新霉素濃度等因素進行考察，進一步完善與補充了DMSO介導的新霉素抗性導入無活性真菌篩選方法，運用氨基糖苷類抗生素對真菌進行抗性篩

5、選，從而將無活性真菌轉化為活性菌株資源。
　　通過建立的DMSO介導的新霉素抗性篩選方法對無活性深海來源真菌雜色曲霉ZBY-3進行處理，共分離得到了33株的在形態(tài)學上有差異的抗性突變株，其中的12株的發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物在100μg/mL時對人慢性髓源性白血病細胞K562細胞有大于30％的抑制增殖生長的活性（占總的抗性突變株數(shù)目的36.4％），并且通過TLC薄層分析，可以看出活性突變株的次級代謝產(chǎn)物中，生成了原始菌株ZBY-3

6、所不能代謝產(chǎn)生的物質，這些結果表明，利用本章節(jié)所表述的研究方法，通過DMSO介導下的新霉素導入無活性深海真菌，確實能夠改造原始菌株，并獲得新的活性次級代謝產(chǎn)物，從而拓展可供研究活性產(chǎn)物的菌株來源。
　　另一方面，通過建立的超聲介導下的高濃度新霉素抗性篩選方法對無活性深海來源真菌雜色曲霉ZBY-3進行處理，共分離得到了30株的在形態(tài)學上有差異的抗性突變株，通過一系列的抗腫瘤細胞活性測試、抗菌活性測試，17株抗性突變株的次級代謝產(chǎn)物在

7、100μg/mL濃度下對K562細胞抑制率超過30％，活性轉化率達56.7％，其中的10株次級代謝產(chǎn)物對K562細胞的抑制率穩(wěn)定大于50％，另外的7株次級代謝產(chǎn)物對K562細胞的抑制率穩(wěn)定地介于30％到50％;6株抗性突變株的次級代謝產(chǎn)物在紙片法測量抑菌活性的實驗中，750μg/紙片的濃度下，有6株抗性突變株對大腸埃希菌ATCC(@)25922有抑菌活性，活性轉化率達到20％。結合TLC與HPLC-PDAD-UV對比圖，以及結合抗性突變

8、株的活性強弱，基于產(chǎn)物的豐富程度，我們選擇了200-2003h1-2作為下一步次級代謝產(chǎn)物研究的對象。
　　針對活性突變株200-2003h1-2，我們開展了抗性驗證實驗，在同樣條件下對原始菌株ZBY-3和目標菌株200-2003h1-2同時進行抗性試驗，從而驗證了200-2003h1-2的新霉素抗性被成功導入。進而對抗性突變株進行大量發(fā)酵，并通過活性追蹤的方法，將抗性突變株的次級代謝產(chǎn)物與原始菌株進行比對，分離并且純化原始菌株所

9、不產(chǎn)的，突變株代謝產(chǎn)物中所新產(chǎn)的6個單體化合物:Cyclo(D-Pro-D-Phe)(1)、Cyclo-(D-tyrosyl-D-proline)(2)、Phenethyl5-oxoprolinate(3)、Cyclo(L-Ile-L-Pro)(4)、Cyclo(L-Leu-L-Pro)(5)、3β,5α,9α-Trihydro xy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(6)，其中化合物2是新天然產(chǎn)物，化

10、合物3為新化合物。這些產(chǎn)物在100μg/mL對K562，HL60，BGC-823，Hela細胞均有或弱或強的抗腫瘤活性。其中化合物1，2，6對K562細胞的IC50值分別為399.5μM(1)，303.7μM(2)，221.0μM(6)，化合物1，2，3，6對HL-60細胞的IC50值分別為225.6μM(1)，254.7μM(2)，215.1μM(3)，89.1μM(6)，化合物1，2，6對BGC-823細胞的IC50值分別為242.

11、2μM(1)，328.7μM(2)，177.7μM(6)，化合物3，6對Hela細胞的IC50值分別為194.5μM(3)，224.3μM(6)，并且通過HPLC-MS驗證了這六個化合物為原始菌株所不生產(chǎn)，而是抗性突變株所新生產(chǎn)的。
　　總而言之，在本研究中，以深海來源無活性野生菌株為原始菌株，在通過DMSO與超聲介導下的新霉素抗性導入真菌的基礎上，通過體外篩選模型的篩選，實現(xiàn)了無活性菌株的活性化轉化，并獲得了活性突變株，并闡明了