肽鏈釋放因子與tRNA的協(xié)同進化對終止密碼子重新分配的影響.pdf

1、當終止密碼子UAA、UAG或者UGA到達核糖體A位點時，蛋白質翻譯發(fā)生終止。在原核生物和真核生物中，該過程由兩類肽鏈釋放因子共同參與，但是二者的作用機制并不相同。原核生物第一類肽鏈釋放因子有2個:RF1和RF2。RF1由線性三肽反密碼子Pro-Ala-Thr(PAT)識別UAA和UAG，而RF2利用Ser-Pro-Phe(SPF)三肽反密碼子識別UAA和UGA;第二類肽鏈釋放因子RF3在肽鏈釋放后通過GTP水解使第一類釋放因子循環(huán)利用。

2、而真核生物大多數只有一個第一類肽鏈釋放因子，eRF1，負責識別三個終止密碼子，但是它識別終止密碼子的機制并不清楚;第二類肽鏈釋放因子eRF3則促進某些終止信號的識別，并通過eRF1的釋放來調節(jié)新生肽鏈的釋放速率。
　　 由于真核生物中兩類肽鏈釋放因子的協(xié)同作用在肽鏈合成終止和釋放過程發(fā)揮著重要的作用，而在原核生物中，第二類肽鏈釋放因子RF3只能協(xié)同GTP在翻譯終止后促使RF1/2從核糖體上解離，兩者之間沒有相互作用關系。學者認為

3、滴蟲線粒體形成之間產生，是原生動物中最為原始的一個類群。其肽鏈釋放因子的結構與進化程度較高的纖毛蟲和高等真核生物相比具有明顯的差異。在本實驗中，我們將克隆得到的滴蟲兩類肽鏈釋放因子的基因Tv eRF1和Tv eRF3分別連接到酵母表達載體pGADT7和pGBKT7中，然后共轉化酵母菌株AH109。利用酵母雙雜交技術我們證實滴蟲的eRF1和eRF3存在相互作用關系，說明滴蟲的兩類肽鏈釋放因子通過相互作用，協(xié)同參與蛋白質翻譯終止過程。這為進

4、一步研究參與蛋白質翻譯終止的肽鏈釋放因子的進化和生物的進化之間的關系提供了數據支持。
　　 在進化過程中纖毛蟲把部分公認的終止密碼子重新分配成有義密碼子。草履蟲、四膜蟲、棘尾蟲和尖毛蟲只用UGA做為終止密碼子，而用UAA和UAG編碼谷氨酸;而游仆蟲則將UGA翻譯為半胱氨酸，UAA和UAG識別為終止密碼子。有研究認為纖毛蟲密碼子的重分配可能由RF結構和功能的變化、突變壓力和新的tRNA出現引起，其中eRF1結構上的改變可能在終止密

5、碼子的重分配中起主要作用。
　　 首先本實驗構建了原生動物賈第蟲eRF1雜合基因G1/Sc eRF1，它由賈第蟲eRF1的N端和釀酒酵母eRF1的M端、C端結構域組成。把該重組質粒轉入敲除內源eRF1的酵母菌株YDB447中分析其識別終止密碼子的活性和性質。質粒洗牌技術的研究結果表明，G1/Sc eRF1作為唯一的eRF1能支持細胞生長，而雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析卻發(fā)現G1/Sc eRF1不識別三個終止密碼子。對eRF1N端的關鍵

6、氨基酸突變后發(fā)現GTS環(huán)結構可能負責識別UAG中的第三位堿基G3，而“YCF”模體對UGA的識別最為有效。
　　 其次我們在先前構建好的Eo/Sc eRF1b的基礎上，對eRF1識別終止密碼子3個堿基的三個“口袋（cavity）”結構周圍的關鍵氨基酸進行組合突變發(fā)現，口袋1周圍的關鍵氨基酸的突變使得Eo eRF1b識別UAA和UAG的第二位堿基A2;M51、E55、Y125的突變與UGA的識別最相關。另外，本實驗還從八肋游仆蟲中