Caveolae-Gαq相互作用在機械刺激誘導心肌肥大反應中的作用.pdf

1、高血壓，血容量增加，局部心肌缺血損傷或先天性心肌疾病等均可導致局部或整體的心肌細胞負荷增加，心肌細胞受過度牽拉作用導致的機械刺激可發(fā)生適應性的代償反應一心肌肥厚。心肌肥厚即是心律失常和猝死的危險因素，也可導致隨后發(fā)生的心肌缺血和心衰反應。目前，對于機械刺激誘導的心肌肥厚反應并沒有明確有效的治療方法，且其發(fā)生機制尚不完全清楚。目前有觀點認為，機械刺激可促進心肌細胞，心肌成纖維細胞或血管內(nèi)皮細胞等分泌一系列促進細胞增生和肥大反應的生物活性物

2、質(zhì)，如血管緊張素II，內(nèi)皮素，緩激肽等。這些生物活性物質(zhì)中有很大一部分為G aq受體的激動劑，可以通過激活細胞內(nèi)G aq受體信號通路進而影響細胞基因的表達和蛋白的合成。這種自分泌/旁分泌的作用被認為是機械刺激誘導心肌肥大反應過程中的一個重要機制。有證據(jù)表明，Caveolae可感受細胞外的機械刺激并在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用。我們的前期研究結果表示Gaq蛋白及其偶聯(lián)的受體可能位于Caveolae結構中，且Caveolae可影

3、響G aq受體介導的細胞內(nèi)信號轉導通路的活性。
　　因此，本研究擬探討機械刺激對Caveolae及Gaq信號通路的直接作用，觀察機械刺激除通過自分泌/旁分泌機制間接作用于細胞內(nèi)的G aq信號通路外，可否通過Caveolae直接影響細胞內(nèi)的G aq信號通路，介導下游基因的表達和蛋白的合成。
　　實驗一機械刺激對Caveolae結構和G蛋白與Caveolin蛋白共定位的影響
　　目的：觀察機械刺激對細胞膜表面Caveola

4、e結構和G蛋白與Caveolin蛋白共定位的影響。
　　方法：使用不同滲透壓的Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS)分別處理正常的A10細胞，Caveolin-1基因敲除的A10細胞和Caveolae結構被甲基-P-環(huán)糊精（Methyl-P-Cyclodextrin，mpCD)破壞的A10細胞，觀察機械刺激對細胞直徑的影響。使用焚光共振能量轉移技術（Fluorescence

5、Resonamce Energy Transfbr，F(xiàn)RET)和光漂白后焚光恢復技術（Fluorescence Recovery after Photobleaching，F(xiàn)RAP)觀察機械刺激（150m0sm低滲刺激）對Caveolae結構的影響。隨后米用FRET技術，焚光壽命成像技術（Fluorescence Lifbtim e Imaging Microscopy，F(xiàn)LIM)和免疫熒光（Immunofluorescence，IF)

6、染色技術觀察機械刺激對細胞膜表面蛋白G a q蛋白和恥腎上腺素受體（P2-adrenergic receptor，P2-AR)與Caveolin蛋白間共定位的影響。
　　結果：正常A10細胞在90 mOsm時出現(xiàn)具有統(tǒng)計意義的細胞直徑的變化， Caveolin-1基因敲除的A10細胞和Caveolae結構被mpCD破壞的A10細胞分別在135 mOsm和120m0sm出現(xiàn)具有統(tǒng)計意義的細胞直徑的變化，說明A10細胞在Caveola

7、e結構消失后對機械刺激的作用更加敏感。機械刺激可減少A10細胞膜表面GFP-Caveolin-1蛋白與 mCherry-Caveolin-1蛋白間的FRET值，使 Caveolae結構內(nèi)C aveolin-1蛋白間的距離增加。機械刺激不影響A10細胞膜表面轉染的GFP-Caveolin-1蛋白的FRAP結果，但可使Alexa Fluor-488標記的A10細胞膜表面內(nèi)源性Caveolin-1蛋白的FRAP速率增加，時間變短。說明機械刺激

8、可增加細胞膜表面Caveolae的直徑，并改變其主要結構蛋白Caveolin-1的構象。Gaq蛋白與Caveolin蛋白間存在共定位現(xiàn)象，且機械刺激可使A10細胞和狗原代心室肌細胞膜表面Caveolin-1/3蛋白與Gctq蛋白間的距離增加，共定位減少，F(xiàn)RET值降低。但A10細胞膜表面[32-AR受體與Caveolin-1蛋白間不存在FRET現(xiàn)象，且不受機械刺激的影響。這說明機械刺激可特異性影響細胞膜表面部分G蛋白與Caveolin蛋

9、白的共定位。結論：Caveolae可緩沖機械刺激對細胞形態(tài)和體積的影響；機械刺激可破壞細胞膜表面Caveolae的正常結構，改變Caveolin-1蛋白的構象，增加Caveolae的直徑;進而影響細胞膜表面Gaq蛋白與Caveolin蛋白間的距離。
　　實驗二機械刺激對細胞膜表面Caveolae結構及其相關蛋白共定位的超清晰顯微成像研究
　　目的：觀察緩激肽受體B2受體（Bradykinin Receptor B2，B2R)

10、，Gaq和G a i蛋白在Caveolae結構內(nèi)的定位以及機械刺激對其的影響。
　　方法:采用隨機光學重建顯微技術（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy， STORM)觀察A IO細胞膜表面Caveolae的結構以及機械刺激對其結構的影響，使用Image J軟件分析所得到的圖像，比較機械刺激對A10細胞膜表面Caveolae直徑和形態(tài)的影響。采用超清晰顯微成像技術STORM觀察A

11、10細胞膜表面B2R，Gaq和Gai蛋白與Caveolin-1蛋白的共定位關系以及機械刺激對其的影響。使用Anaconda軟件分析所得到的圖像，比較機械刺激對A10細胞膜表面Caveolin-1蛋白與B2R，Gaq和Gai蛋白間的距離分布直方圖，以及機械刺激對其的影響，隨后將所得到的圖像使用Im ageJ軟件進行最近鄰點距離（NeajestNeighborDistance，NND)分析，比較A10細胞膜表面Caveolin-1，B2R，

12、Gaq和G ai蛋白的分布及機械刺激對其的影響。
　　結果：Caveolae為細胞膜表面50?100 n m大小的凹陷結構，機械刺激可增加Caveolae的直徑，改變Caveolae的形態(tài)，但不釋放Caveolin-1蛋白。機械刺激可增加B2R受體和G aq蛋白與Caveolin-1蛋白分子間的距離，使B2R受體和G aq蛋白與Caveolin-1蛋白間距離分布直方圖的峰值右移，但不影響G a i蛋白與Caveolin-1蛋白間的

13、距離。Caveolin-1蛋白在細胞膜表面的分布集中在40nm左右的范圍內(nèi)，機械刺激可使Caveolin-1蛋白的分布曲線右移。而B2R受體，Gaq蛋白和G a i蛋白在細胞膜表面的分布集中在80 n m左右的范圍內(nèi)，且機械刺激對其分布影響不明顯。
　　結論：B2R，Gaq和Gai三種蛋白均可位于Caveolae結構中，機械刺激使B2R受體和G a q蛋白與Caveolin-1蛋白間的距離增加，但不影響Gai蛋白與Caveolin

14、-1蛋白間的距離。
　　實驗三機械刺激對細胞膜表面受體的運動和寡聚化狀態(tài)的影響
　　目的：觀察機械刺激對細胞膜表面Caveolin-1蛋白，B2R和恥-AR受體分布，運動以及寡聚化狀態(tài)的影響。
　　方法:采用Z-stack掃描技術，觀察A10細胞膜表面Caveolin-1蛋白，B2R和p2-AR受體的分布以及機械刺激對其的影響。使用焚光相關光譜技術（Fluorescence CorrelationSpectroscop

15、y，F(xiàn)CS)，觀察A10細胞膜表面B2R受體和P2-AR受體的運動情況以及機械刺激對其的影響。將所得到的FCS數(shù)據(jù)進行光子計數(shù)直方圖（Photon CountHistogram，PCH)分析，觀察A10細胞膜表面B^R受體和p2-AR受體的寡聚化狀態(tài)以及機械刺激對其的影響。
　　結果：Caveolin-1蛋白，B2R受體和R-AR受體均集中于A10細胞的基底細胞膜，在頂端細胞膜的分布較少，機械刺激可促進Caveolin-1蛋白和[

16、32-A R受體向頂端細胞膜移動，但不影響B(tài)2R受體在細胞膜表面的分布。B2R受體和p2-A R受體在A10細胞膜表面的運動均可分為兩組，一組受體在細胞膜表面的運動較快，另一組受體在細胞膜表面的運動較慢，在A10細胞的頂端細胞膜和底端細胞膜均可觀察到這種現(xiàn)象，且機械刺激不影響A10細胞膜表面B2R受體和[32-AR受體的運動能力。此外，B2R受體和h-AR受體在A10細胞膜表面均可以單聚體和寡聚體兩種形式存在，在A10細胞的頂端細胞膜和

17、底端細胞膜均可觀察到這種現(xiàn)象，且機械刺激不影響A10細胞基底細胞膜和頂端細胞膜B2R受體和恥-AR受體的寡聚化狀態(tài)。
　　結論：機械刺激促進Caveolin-1蛋白和恥-AR受體向頂端細胞膜移動，但不影響B(tài)2R在細胞膜表面的分布；機械刺激不影響B(tài)2R受體和恥-AR受體在A10細胞膜表面的運動和寡聚化狀態(tài)。
　　實驗四機械刺激對G蛋白介導的細胞內(nèi)信號通路的影響
　　目的：觀察機械刺激對G蛋白介導的細胞內(nèi)信號通路的影響

18、r>　　方法：采用媽離子特異性焚光標記物Fura-2和Calcium Green記錄A10細胞內(nèi)Gaq-PLCp_Ca2+信號通路對 M型膽堿能受體（Muscajinic Acetylcholine Receptors， mAchRs)激動劑Carbachol的反應，以及機械刺激對其的影響。同時觀察Carbachol對Caveolim-1基因敲除的A10細胞和Caveolae結構被mpCD破壞的A10細胞內(nèi)Gaq-PLCP-Ca2+信號

19、通路的影響。采用鈣離子熒光標記物Fum-2記錄A10細胞內(nèi)Ca2+濃度對細胞外生長因子刺激的反應，以及機械刺激對其的影響。采用cA M P探針I(yè)CUE3，觀察[3腎上腺素受體激動劑Isoprenaline對細胞內(nèi)Gas/God-AC-cAMP信號通路的影響，以及機械刺激對其的影響。
　　結果：機械刺激可減弱Carbachol誘導的A10細胞內(nèi)Gaq-PLCp_Ca2+信號通路的激活，Caveolin-1基因敲除或Caveolae結

20、構破壞具有同樣的作用，也可減弱Carbachol誘導的A10細胞內(nèi)Gaq-PLCP-Ca2+信號通路的激活，且Caveolin-1基因敲除后，機械刺激對Carbachol誘導的細胞內(nèi)Gaq-PLC]3-Ca2+信號通路無影響。與 Carbachol誘導的細胞內(nèi)Ca2+反應相比，生長因子誘導的細胞內(nèi)Ca2+反應速度較慢，幅度較小，且對機械刺激無影響。與Carbachol誘導的細胞內(nèi)Ca2+反應相比，Isoprenaline誘導的細胞內(nèi)cA

21、MP反應速度較慢，持續(xù)時間較長，且不受機械刺激的影響。
　　結論:機械刺激可減弱Carbachol誘導的細胞內(nèi)Gaq-PLC)3-Ca2+信號通路的激活，但不影響生長因子誘導的細胞內(nèi)Ca2+反應和Isoprenaline誘導的細胞內(nèi)Gas/Gai-AC-cAMP信號通路的變化。
　　小結:
　　通過以上四部分實驗，我們發(fā)現(xiàn)機械刺激可改變細胞膜表面Caveolae的結構，增加Caveolae的直徑，減少Caveolin蛋