GSK-3β對小鼠骨髓樹突狀細胞成熟和功能的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　本實驗構建GSK-3β基因的過表達載體并轉染樹突狀細胞系DC2.4，觀察過表達GSK-3β對RelB蛋白水平的影響，以探究GSK-3β通過調節(jié)RelB的表達影響DC活化成熟的新機制，為確立GSK-3β作為自身免疫性疾病治療的新靶點提供充分的科學依據。
　　方法：
　　1.小鼠BMDC的體外培養(yǎng)和鑒定以及GSK-3β的活性檢測
　　采用我們實驗室建立的方法，以低劑量的rmGM-CSF和rmIL-4在體外

2、大規(guī)模誘導培養(yǎng)小鼠骨髓細胞分化成iDC和mDC。培養(yǎng)6天收集的細胞為iDC;收集前一天加入LPS刺激24h的細胞為mDC。兩種細胞均通過CD11c+免疫磁珠分選純化，并采用流式細胞術(FCM)檢測CD11c的陽性率以鑒定細胞純度、檢測表面共刺激分子CD40和CD86的表達以鑒定細胞表型;利用qRT-PCR檢測細胞因子表達情況;利用混合淋巴細胞反應(MLR)檢測DC刺激同種異基因T細胞增殖的能力。目的在于建立體外大規(guī)模培養(yǎng)iDC和mDC的

3、體系，為后續(xù)研究DC活化成熟的機制奠定實驗基礎。利用LPS處理iDC30min和60min，western blotting檢測GSK-3β的磷酸化水平，以觀察GSK-3β在LPS誘導DC活化成熟過程中的活性變化。
　　2.GSK-3β對小鼠BMDC成熟和功能的作用和機制
　　利用GSK-3β的活性抑制劑SB216763處理原代BMDC24h，觀察抑制GSK-3β的活性對BMDC成熟和功能的影響。FCM檢測表面共刺激分子CD

4、40和CD86的表達變化;qRT-PCR檢測細胞因子IL-6、IL-12和IL-10 mRNA的表達;MLR檢測其功能的變化。構建過表達GSK-3β的慢病毒載體并轉染細胞系DC2.4，western blotting檢測GSK-3β的過表達效率以及過表達GSK-3β對RelB蛋白水平表達的影響。
　　結果：
　　1.小鼠BMDC的體外培養(yǎng)和鑒定以及GSK-3β的活性檢測
　　1.1 小鼠骨髓樹突狀細胞體外培養(yǎng)觀察情況<

5、br>　　培養(yǎng)至第六天，iDC集落逐漸增多增大，大多數仍疏松貼壁生長。iDC體積增大并開始伸出細小突起。經LPS刺激后，單個細胞從集落釋放成為懸浮細胞，其個體增大，表面突起明顯變長變粗，呈樹枝狀，具有典型mDC的形態(tài)特征。
　　1.2 小鼠BMDC的純度和表型鑒定
　　CD11c是經典DC相對特異的表面標志，細胞表面CD11c的陽性率代表DC的純度。我們利用免疫磁珠法純化收集的細胞，再利用FCM檢測細胞表面分子CD11c、C

6、D40和CD86的表達，鑒定細胞的純度和成熟度。經磁珠分選后，DC的純度達到90％以上，符合分子生物學實驗的要求。iDC組低表達共刺激分子CD40和CD86，而mDC組高表達CD40和CD86，完全符合imDC和mDC的表型特征。
　　1.3 小鼠BMDC細胞因子IL-6和IL-12 mRNA的表達情況
　　收集兩組純化后的細胞，qRT-PCR法檢測IL-6和IL-12的表達。結果顯示，iDC中IL-6(P＜0.05)和IL

7、-12(P＜0.05)的mRNA水平顯著低于mDC。
　　1.4 單向MLR評價小鼠BMDC刺激T細胞增殖的功能
　　將兩組純化后的DC分別按1∶10的比例與初始T淋巴細胞混合培養(yǎng)72小時，用CCK-8法檢測T細胞的增殖情況。iDC組T細胞的相對增值率為(0.51±0.06)，mDC組為(1.14±1.20)，iDC組刺激T細胞活化的能力顯著低于mDC組(P＜0.01)。
　　1.5 GSK-3β在LPS誘導DC活化成

8、熟過程中的活性變化
　　iDC GSK-3β216位酪氨酸(Tyr216)的磷酸化水平較高，而第9位絲氨酸(Ser9)的磷酸化水平較低，說明iDC中GSK-3β具有較高的活性。在LPS刺激后，Ser9的磷酸化水平顯著高于未刺激組，相對應的Tyr216第則明顯低于未刺激組，說明iDC經LPS刺激活化后GSK-3β活性下降。
　　2.GSK-3β對小鼠BMDC成熟和功能的作用及機制
　　2.1 抑制GSK-3β的活性對BM

9、DC成熟和功能的影響
　　SB216763處理組與iDC組相比，表面共刺激分子CD40(P＜0.01)和CD86(P＜0.01)的表達顯著上調，分別是未處理組的2.5和2.4倍;促炎因子IL-6(P＜0.05)和IL-12(P＜0.05)mRNA水平顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義，而抑炎因子IL-10 mRNA的表達顯著上調（P＜0.01）;SB216763處理組DC刺激同種異基因T細胞增殖的能力較弱，與iDC相比沒有顯著差異。說明抑

10、制GSK-3β促進DC表型成熟，但是其對促炎細胞因子的表達起抑制作用，且其刺激MLR的能力相當有限，提示抑制GSK-3β的活性不能激活DC完全成熟，經SB216763處理的DC在功能上仍然屬于一種耐受型DC。另外，SB216763能夠抑制LPS誘導IL-6（P＜0.05）和IL-12(P＜0.01)的表達上調，促進LPS誘導的IL-10的表達上調(P＜0.01)，阻斷經LPS誘導成熟的DC刺激同種異基因T細胞增殖的功能，提示GSK-3β

11、在LPS刺激DC活化過程中發(fā)揮促炎作用。
　　2.2 抑制GSK-3β對RelB表達的影響
　　利用攜帶小鼠GSK-3β基因的慢病毒載體轉染DC2.4細胞，western blotting結果顯示，GSK-3β過表達組中GSK-3β的表達明顯高于空白對照組和空載轉染組，相對應的RelB的表達低于空白對照組和空載轉染組，說明過表達GSK-3β能下調RelB蛋白的水平。
　　結論：
　　1.利用低濃度的rmGM-CS

12、F和rmIL-4刺激誘導小鼠BMDC分化形成大量的iDC，經磁珠分選后其純度可達90％以上，iDC經LPS誘導形成mDC。經形態(tài)學、表型和功能分析，該方法培養(yǎng)的iDC和mDC完全符合DC的特征。
　　2.iDC中GSK-3β具有較高的活性，在LPS刺激后其活性顯著降低，提示LPS可能通過誘導GSK-3β的失活調節(jié)DC的活化和成熟過程。
　　3.GSK-3β參與DC活化成熟的調控機制，一方面，高活性的GSK-3β抑制iDC的自