肝再生增強(qiáng)因子在缺血性急性腎損傷中對(duì)TLR4信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　缺血再灌注損傷(IRI)引起的急性腎損傷(AKI)是臨床常見疾病，其發(fā)病率和死亡率較高，現(xiàn)仍缺乏有效的防治方法。近年來天然免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是研究腎IRI發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)之一。大量研究已經(jīng)證實(shí)，Toll樣受體(TLR)4所介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。腎臟缺血后，大量的內(nèi)源性配體從損傷的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中釋放，與TLR4受體結(jié)合后活化下游信號(hào)通路，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和

2、趨化因子，介導(dǎo)IRI后炎癥反應(yīng)。阻斷TLR4信號(hào)通路的激活對(duì)急性缺血性腎損傷有明顯的改善作用。
　　肝再生增強(qiáng)因子(ALR)是一種能促進(jìn)肝細(xì)胞再生的細(xì)胞因子，我們前期研究發(fā)現(xiàn)ALR在腎皮質(zhì)、髓質(zhì)小管區(qū)高表達(dá)，外源性加入ALR能抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖，對(duì)腎組織起保護(hù)作用。近來，研究發(fā)現(xiàn)ALR在肝臟有免疫調(diào)控作用，最新的體外活性研究進(jìn)一步揭示ALR對(duì)激活的免疫細(xì)胞具有很強(qiáng)的免疫抑制作用。那么在腎IRI中，ALR對(duì)腎臟的這種

3、保護(hù)作用是否通過其對(duì)免疫炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)，目前尚不清楚。
　　在本研究中，我們首先擬通過體外實(shí)驗(yàn)，采用大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E細(xì)胞）缺氧復(fù)氧模型模擬腎臟IRI過程，觀察加入ALR對(duì)腎小管上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，繼而進(jìn)一步通過體內(nèi)試驗(yàn)深入探討ALR對(duì)TLR4信號(hào)通路的作用機(jī)制，明確在缺血性AKI時(shí)，ALR通過抑制腎臟免疫炎癥反應(yīng)從而減輕腎臟損傷，保護(hù)腎臟功能。
　　方法:
　　體外研

4、究:
　　1.將體外培養(yǎng)的NRK-52E分成對(duì)照組、模型組、不同濃度重組大鼠ALR(rr ALR)干預(yù)組(25ug/ml，50ug/ml)，采用缺氧復(fù)氧的方法，模擬IRI過程。分別在缺氧復(fù)氧6h/12h，24h和72h時(shí)，收集細(xì)胞檢測(cè);
　　2.采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)TLR4和NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)
　　3.ELISA檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子IL-6，IL-1β蛋白表達(dá)水平。
　　體內(nèi)研

5、究:
　　1.將雄性大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、不同濃度重組人ALR(rhALR)干預(yù)組（100μg/kg，200μg/kg），采用雙側(cè)夾閉腎蒂60min，模擬IRI過程。分別在再灌注后24h，48h和72h處死大鼠，收集標(biāo)本檢測(cè)。
　　2.采用常規(guī)生化法檢測(cè)各組大鼠血尿素氮和肌酐的差異;HE染色和TUNEL法檢測(cè)各組大鼠腎組織病理學(xué)變化和腎小管細(xì)胞凋亡情況;
　　3.免疫組化法檢測(cè)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在各組大鼠腎組

6、織中的浸潤(rùn)程度;
　　4.ELISA法檢測(cè)各組大鼠腎組織促炎細(xì)胞因子和趨化因子蛋白表達(dá)水平;
　　5.real-time PCR和免疫組化法檢測(cè)各組大鼠腎組織TLR4和其內(nèi)源性配體的表達(dá)差異;
　　6.western blot，real-time PCR和免疫組化檢測(cè)各組大鼠TLR4下游信號(hào)分子MAPKs和NF-κB的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　體外研究:
　　1.NRK-52E細(xì)胞缺氧復(fù)氧后，TLR

7、4和NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，rrALR干預(yù)后可明顯下調(diào)TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)程度，rrALR高劑量處理組組較低劑量處理組組TLR4和NF-κB的表達(dá)水平下調(diào)更明顯（P＜0.05）。
　　2.ELISA法檢測(cè)顯示對(duì)照組IL-6，IL-1β蛋白低水平表達(dá)，細(xì)胞缺氧復(fù)氧后12h其表達(dá)明顯增加，外源性加入rrALR呈濃度依賴性下調(diào)IL-6，IL-1β蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　體內(nèi)研究:

8、r>　　1.I/R+saline組大鼠的血肌酐和尿素氮在術(shù)后24h開始明顯上升，之后逐漸下降（P＜0.05）;I/R+rhALR處理組的血肌酐和尿素氮較模型組明顯下降，rhALR高劑量組(I/R+rhALR2)較rhALR低劑量組(I/R+rhALR1)腎功能改善更明顯(P＜0.05)。
　　2.HE染色提示，模型組大鼠術(shù)后24h在皮質(zhì)區(qū)和外髓質(zhì)區(qū)可以看見典型的腎小管壞死，包括腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重變性、崩解和脫落，腎小管管腔擴(kuò)張，腎

9、間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);rhALR處理組的腎組織損傷程度均較模型組有所減輕，rhALR2處理組較rhALR1處理組病理改善更明顯，與腎臟損傷半定量評(píng)分結(jié)果一致(P＜0.05)。
　　3.假手術(shù)組腎組織中僅見到極其少量的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，模型組組大鼠術(shù)后24h,48h和72h見到大量TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，主要分布在腎臟的皮質(zhì)區(qū)和外髓質(zhì)區(qū)，在24h時(shí)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)最多，rhALR處理組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均

10、較模型組明顯減少，rhALR高劑量處理組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較rhALR低劑量處理組明顯減少(P＜0.05)。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示假手術(shù)組僅有少量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，大鼠腎臟缺氧再灌注后可見大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腎間質(zhì)，其中中性粒細(xì)胞在再灌注后24h達(dá)最高峰，巨噬細(xì)胞在再灌注后72h達(dá)峰值。rhALR處理組在各時(shí)間點(diǎn)均能明顯緩解中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，并呈濃度依賴性(P＜0.05)。
　　5.real

11、-time PCR和ELISA提示腎臟缺血再灌注損傷后，腎組織中IL-1β、IL-6和TNF-α、MCP-1和MIP-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05);外源性加入rhALR后，上訴炎性細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)明顯減少，其中rhALR高劑量處理組的表達(dá)水平低于rhALR低劑量處理組（P＜0.05）。
　　6.real-time PCR結(jié)果顯示模型組TLR4受體及其內(nèi)源性配體(HMGB1、biglycan、HAS1、H

12、AS2、HAS3)mRNA表達(dá)在術(shù)后24小時(shí)即明顯上升（P＜0.05）;rhALR高劑量處理組和低劑量處理組均能明顯下調(diào)其mRNA表達(dá)水平，并呈濃度依賴性(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示TLR4在術(shù)后明顯增多，主要分布在腎小管上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞上(P＜0.05);外源性加入rhALR能明顯減少TLR4在腎組織的表達(dá)水平，rhALR高劑量處理組較低劑量處理組TLR4蛋白表達(dá)量更少(P＜0.05)。
　　7.western b

13、lot顯示大鼠在術(shù)后，腎組織中pERK/ERK，pJNK/JNK，pp38/p38均明顯升高，而rhALR處理組能明顯降低ERK、JNK、p38的磷酸化水平(P＜0.05)。real-time PCR和免疫組化結(jié)果提示與假手術(shù)組相比，模型組腎組織NF-κB核酸和蛋白表達(dá)水平均明顯上升，rhALR高劑量處理組和低劑量處理組均能顯著降低NF-κB核酸和蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　體外研究:
　　rrA

14、LR對(duì)NRK-52E細(xì)胞TLR4致炎信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能是通過干預(yù)TLR4表達(dá)，抑制NF-κB激活，從而減少IL-1β、IL-6炎性因子的表達(dá)。
　　體內(nèi)研究:
　　1.對(duì)缺血再灌注腎損傷大鼠外源性腹腔注射rhALR后，腎功能明顯改善，腎臟病理損害減輕，腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少，并具有劑量依賴性，顯示rhALR對(duì)急性缺血性腎損傷有保護(hù)作用。
　　2.rhALR對(duì)急性缺血性腎損傷的保護(hù)作用與減輕腎組織炎癥反應(yīng)有關(guān)。

15、rhALR可能通過減少炎癥細(xì)胞的募集和促炎細(xì)胞因子的合成，減輕腎組織炎癥反應(yīng)。
　　3.rhALR對(duì)腎IRI的這種炎癥抑制作用是通過下調(diào)TLR4內(nèi)源性配體mRNA表達(dá)水平，抑制TLR4的活化，進(jìn)而阻斷TLR4下游信號(hào)分子ERK、JNK、p38和NF-κB信號(hào)分子的激活實(shí)現(xiàn)的。
　　綜合上述兩部分的研究我們得出結(jié)論:ALR對(duì)缺血性AKI過程中的免疫炎癥反應(yīng)呈抑制作用，而這種調(diào)控作用可能是通過抑制TLR4信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制