轉(zhuǎn)HaTLP基因抗蟲棉花的培育與鑒定.pdf

1、棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界性的最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。蟲害是棉花增產(chǎn)的主要限制因素之一，轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲棉為害蟲防治提供了一個(gè)行之有效的方法。近年來，棉花抗蟲基因工程發(fā)展迅速，一系列抗蟲基因工程植株相繼產(chǎn)生。其中，轉(zhuǎn)基因Bt棉的大面積種植和商品化生產(chǎn)，為提高棉花產(chǎn)量，減少農(nóng)藥污染做出了重要的貢獻(xiàn)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。然而，隨著Bt棉的大面積種植，害蟲對(duì)Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的問題越來越引起人們的

2、關(guān)注。因此，尋找新的有效抗蟲基因，同時(shí)開發(fā)更新更安全的抗蟲方法，成為了棉花抗蟲育種工作的重要任務(wù)之一。
　　類胰蛋白酶是昆蟲中腸內(nèi)的一種主要的蛋白水解酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族，被認(rèn)為是肽鏈內(nèi)切酶，具有高度的專一性，特異性識(shí)別精氨酸或者賴氨酸的羧基與其他氨基酸的氨基脫水生成的肽鍵，同時(shí)可以迅速激活其他蛋白酶原而行使其消化蛋功能。昆蟲體內(nèi)類胰蛋白酶的減少或缺失，會(huì)阻滯昆蟲的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致昆蟲死亡。為了研究類胰蛋白酶靶基因沉默后產(chǎn)生

3、的抗蟲效果，我們采用RNA干擾技術(shù)，沉默棉鈴蟲體內(nèi)的類胰蛋白酶基因，以此創(chuàng)制出棉花抗蟲新材料。
　　本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化下胚軸法將包含HaTLP基因的RNA干擾載體（pCAMBIA2300∷HaTLPRNAi）轉(zhuǎn)入棉花W0品系，經(jīng)組織培養(yǎng)再生共得到89個(gè)克隆的再生轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)所有轉(zhuǎn)基因株系的再生植株進(jìn)行DNA提取，用啟動(dòng)子與目的基因組合的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步得到54個(gè)陽性克隆的再生植株，陽性率為60.67％。嫁接成活

4、后，得到了45個(gè)克隆的T0代轉(zhuǎn)基因株系。陽性植株自交后，收獲了17個(gè)克隆的T0代種子，其中一個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系現(xiàn)已得到34株T1代植株。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了室內(nèi)卡那霉素抗性鑒定與PCR分子檢測，篩選得到20株陽性植株。
　　為進(jìn)一步檢測表達(dá)轉(zhuǎn)HaTLP基因片段dsRNA的棉花植株的抗蟲性，我們對(duì)獲得的部分轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行了人工接蟲處理。T0代轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力得到了大大的提高。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)