微流控技術(shù)在聯(lián)合應(yīng)用FK506、NGF促進(jìn)神經(jīng)再生研究中的應(yīng)用.pdf

1、急性脊髓損傷（Acute Spinal Cord Injury，ASCI）是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的一種疾病，隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，其發(fā)病率不斷上升，給患者的家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷包括不可逆性的由由創(chuàng)傷機(jī)制所決定的原發(fā)性損傷和可逆性的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性脊髓損傷在損傷的脊髓組織及周?chē)M織產(chǎn)生了一系列的病理反應(yīng)，如出血、水腫、微循環(huán)障礙、局部組織氧自由基增多等改變，這些病理反應(yīng)加重了脊髓組織的損傷，它所產(chǎn)生的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)原發(fā)性損傷。因此

2、早期應(yīng)用針對(duì)脊髓繼發(fā)性損傷的有效藥物治療不可忽視。
　　 目前國(guó)內(nèi)外研究的治療藥物主要集中在以下幾類(lèi):皮質(zhì)激素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophic factors，NTFS)、興奮性氨基酸(Excitatory Amino acid，EAA)受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑(Calcium Channel Blockers)、抗氧化劑及自由基清除劑(Antioxidants and Free Radical Scavengers)、

3、前列腺素(Prostaglandin，PG)、阿片受體拈抗劑(Opioid Receptor Antagonists)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑和特異性COX-2抑制劑等。目前臨床上公認(rèn)的常用的有肯定療效的藥物是甲基強(qiáng)的松龍(MP)，在脊髓損傷后8小時(shí)內(nèi)應(yīng)用超大劑量的甲基強(qiáng)的松龍可以減輕脊髓損傷后繼發(fā)性水腫，改善微循環(huán)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少氧自由基的生成，減輕鈣離子內(nèi)流，維持神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)神經(jīng)功能

4、的恢復(fù)，從而避免了脊髓組織的進(jìn)一步損傷。但甲基強(qiáng)的松龍的治療時(shí)間僅限在傷后8小時(shí)以內(nèi)，如在脊髓損傷8小時(shí)以后應(yīng)用，不僅效果欠佳，并且會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥。其他藥物大部分只針對(duì)脊髓損傷的某一環(huán)節(jié)有效，而脊髓損傷的繼發(fā)性損傷是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，所以治療效果有限。因此聯(lián)合不同作用機(jī)制的藥物治療脊髓損傷會(huì)成為今后的研究方向。
　　 近年來(lái)，隨著高通量藥物篩選技術(shù)的出現(xiàn)，為實(shí)現(xiàn)藥物篩選的微量、快速和大規(guī)模目標(biāo)開(kāi)辟了新的途徑，但其自身有一定的

5、局限性。如以往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥物篩選多采用多孔板進(jìn)行，不僅在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中消耗的試劑量大，而且在實(shí)驗(yàn)樣品的分配的過(guò)程中操作步驟十分的繁瑣，而微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)則有可能克服高通量藥物篩選的限制。微流控芯片技術(shù)是在微加工技術(shù)的基礎(chǔ)上形成的，它之所以可以成為組織工程研究及藥物篩選的新平臺(tái)是因?yàn)槠渚哂蟹治鲞^(guò)程所消耗的試劑量少、分析速度快，并且本身易于集成和高通量分析等許多優(yōu)點(diǎn)。
　　 他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K506)是一種大環(huán)內(nèi)酯

6、類(lèi)抗生素，具有極強(qiáng)的免疫抑制作用。新近研究表明，F(xiàn)K506具有保護(hù)大鼠脊髓損傷后的局部神經(jīng)組織，促進(jìn)神經(jīng)再生，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)等作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTFS)家族中的一員，廣泛分布于周?chē)M織、外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可誘導(dǎo)NGFR表達(dá)，將外源性NGF注射到脊髓損傷部位，使NGF與NGFR相結(jié)合，可以保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)軸突再生。研究證實(shí)FK506聯(lián)合NGF在促進(jìn)損傷的周?chē)窠?jīng)

7、再生和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的功能方面具有協(xié)同作用，在脊髓損傷的治療中是否也具有相同的作用未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)將微流控芯片技術(shù)引入到促神經(jīng)再生研究領(lǐng)域，構(gòu)建成以PC12細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的促神經(jīng)再生藥物篩選體系，對(duì)FK506、NGF的促神經(jīng)再生作用進(jìn)行探索，并將二者聯(lián)合應(yīng)用治療大鼠急性脊髓損傷，探討二者在促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)上是否具有協(xié)同作用。
　　 實(shí)驗(yàn)一微流控芯片的設(shè)計(jì)、制作及芯片上PC12細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 目的:構(gòu)建

8、成集細(xì)胞培養(yǎng)、藥物干預(yù)及蛋白檢測(cè)為一體的微流控芯片檢測(cè)平臺(tái)。
　　 方法:以Jeon等提出的濃度梯度生成原理為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出一種由濃度梯度生成器(Concentration Gradient Generator，CGG)和細(xì)胞培養(yǎng)單元組成，適用于細(xì)胞水平的促神經(jīng)再生藥物篩選的微流控芯片。微流控芯片的基本材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)和載玻片，SU-8負(fù)膠母板是利用光刻工藝制作而成。母板制成后將聚二甲基硅氧烷采用澆筑法制成含有微通

9、道的基片，并將基片等離子活化后封接到載玻片上，從而制成完整的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片。在芯片上培養(yǎng)PC12細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況。
　　 結(jié)果:構(gòu)建成由上游的濃度梯度生成器(Concentration Gradient Generator，CGG)和下游的細(xì)胞培養(yǎng)單元組成的微流控芯片。實(shí)現(xiàn)了芯片上細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 結(jié)論:在微流控芯片上可成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)，為進(jìn)一步的藥物干預(yù)，及蛋白檢測(cè)提供可靠的檢測(cè)平臺(tái)。
　　 實(shí)

10、驗(yàn)二運(yùn)用微流控芯片探討FK506、NGF對(duì)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的影響
　　 目的:基于微流控芯片檢測(cè)平臺(tái)及PC12細(xì)胞，構(gòu)建成促神經(jīng)生長(zhǎng)藥物篩選體系，對(duì)FK506、NGF的促神經(jīng)再生作用進(jìn)行探索，為二者聯(lián)合應(yīng)用治療神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法:利用三個(gè)不同的微流控芯片上的濃度梯度生成器生成不同的FK506、NGF以及二者聯(lián)合的濃度梯度，作用于芯片上細(xì)胞培養(yǎng)單元中培養(yǎng)的PC12細(xì)胞48小時(shí)，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法

11、測(cè)定PC12細(xì)胞NF200表達(dá)情況以反映其軸突生長(zhǎng)程度，以此篩選出FK506、NGF促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的最佳藥物配伍濃度。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及有效性，我們?cè)谙嗤瑢?shí)驗(yàn)條件下采用多孔板法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:FK506在200nM的濃度下使PC12細(xì)胞NF200表達(dá)最強(qiáng)，NGF在50ng/mL的濃度下使PC12細(xì)胞NF200表達(dá)最強(qiáng)，F(xiàn)K506(114.29nM)與NGF(21.43ng/mL)的組合使PC12

12、細(xì)胞NF200表達(dá)最強(qiáng)，軸突產(chǎn)生最大的生長(zhǎng)效應(yīng)。與多孔板法進(jìn)行比較顯示兩種結(jié)果無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用FK506、NGF在促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)中具有協(xié)同作用，F(xiàn)K506(114.29nM)與NGF(21.43ng/mL)的組合在PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)中具有最大促進(jìn)作用。與傳統(tǒng)檢測(cè)平臺(tái)相比，微流控芯片具有分析過(guò)程中所消耗的試劑量少、分析速度快，并且本身易于集成和高通量分析等許多優(yōu)點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)

13、三聯(lián)合應(yīng)用FK506、NGF治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察聯(lián)合應(yīng)用FK506、NGF對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的影響。
　　 方法:120只SD大鼠隨機(jī)分成損傷對(duì)照組、FK506治療組、NGF治療組、FK506聯(lián)合NGF治療組，假手術(shù)組。采用Allen's法制造大鼠急性脊髓損傷模型，于造模后30分鐘各治療組分別予FK506(0.3mg/kg)，NGF(40ug/kg)，F(xiàn)K506+NGF(0.3mg

14、/kg+40ug/kg)腹腔注射治療，以后每日一次，持續(xù)治療一周。大鼠脊髓損傷后的第3、7、14，21天采用HE染色觀察脊髓組織病理變化，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NF200表達(dá)情況，采用RT-PCR方法檢測(cè)NF200mRNA表達(dá)情況，并且采用BBB評(píng)分觀察脊髓功能恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果:傷后第7、14、21天，各治療組在BBB評(píng)分、NF200表達(dá)，NF200mRNA表達(dá)上均高于損傷對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其中聯(lián)合