RNA干擾技術(shù)提高甘藍(lán)型油菜含油率研究.pdf

1、油菜是世界重要油料作物之一,是我國(guó)重要的食用油來(lái)源。我國(guó)消費(fèi)的食用油40％以上靠油菜籽提供。我國(guó)是油菜種植大國(guó),種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一。每年我國(guó)種植油菜在1億畝左右,產(chǎn)油菜籽1400萬(wàn)噸左右,含油率40％左右,提供食用油500萬(wàn)噸左右。每年我國(guó)食用油消費(fèi)的缺口在1100萬(wàn)噸以上,提高我國(guó)油菜品種的含油率,是目前解決我國(guó)食用油短缺的當(dāng)務(wù)之急。我國(guó)油菜籽含油率低于加拿大、澳大利亞、歐盟等,油菜籽進(jìn)口主要從加拿大和澳大利亞。
　　

2、 近年來(lái),生物技術(shù)發(fā)展迅猛,特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因干擾表達(dá)技術(shù)(RNAi),對(duì)作物資源創(chuàng)新、品種選育、基因表達(dá)研究等提供了先進(jìn)的技術(shù)支持,降低品種選育周期,降低成本、提高了效率。日本學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)大豆、油菜籽中油脂儲(chǔ)存與蛋白質(zhì)成負(fù)相關(guān)關(guān)系,我國(guó)學(xué)者陳錦清利用這一原理,提出了油菜籽中蛋白質(zhì)與油脂積累的“底物競(jìng)爭(zhēng)假說(shuō)”。根據(jù)這一假說(shuō),丙酮酸是蛋白質(zhì)和脂肪酸合成的共同底物,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)丙酮酸完成蛋白質(zhì)和油質(zhì)的積累。在油菜種子發(fā)育過(guò)程中,光合作用所

3、產(chǎn)生的糖類物質(zhì),經(jīng)過(guò)糖酵解作用產(chǎn)生丙酮酸(PEP),丙酮酸經(jīng)過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的作用生成草酰乙酸,進(jìn)入蛋白質(zhì)代謝途徑。丙酮酸經(jīng)過(guò)丙酮酸脫氫酶系(乙酰輔酶A羧化酶)催化生成乙酰CoA,乙酰CoA是合成脂肪酸的前體物質(zhì),最終進(jìn)入脂肪酸合成代謝途徑。由此,抑制蛋白質(zhì)的合成在一定程度上就能提高油質(zhì)的積累。丙酮酸是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化進(jìn)入蛋白質(zhì)代謝途徑的,因此,抑制PEPC基因的表達(dá),就可能抑制蛋白質(zhì)積累,

4、最終提高油質(zhì)的含量。
　　 本研究應(yīng)用RNAi干擾表達(dá)技術(shù),從甘藍(lán)型油菜中克隆PEPC酶活性位點(diǎn)序列,構(gòu)建ihpRNA遺傳表達(dá)載體。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將遺傳表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體植株,并對(duì)轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行鑒定,并分析轉(zhuǎn)化后代植株P(guān)EPC基因表達(dá)量的變化以及轉(zhuǎn)基因后代植株的蛋白質(zhì)、含油率、脂肪酸成分的變化。本研究從PEPC基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、基因表達(dá)、脂肪酸分析,全面詳細(xì)的研究PEPC基因抑制后對(duì)油菜含油率、蛋白質(zhì)、脂肪酸成分的變

5、化的影響,為RNA干擾技術(shù)以及PEPC基因應(yīng)用研究奠定了理論基礎(chǔ)。其主要研究結(jié)果包括:
　　 1.通過(guò)NCBI檢索甘藍(lán)型油菜PEPC基因全序列(D13987),Blast比對(duì)PEPC基因的保守序列,發(fā)現(xiàn)PEPC基因全序列6603bp,共有9個(gè)外顯子,8個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)polyA的信號(hào)尾巴,位于第4號(hào)外顯子內(nèi)的2637-2859序列保守性最強(qiáng)。利用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PEPC基因的功能區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)PEPC基因存在2個(gè)酶活性位

6、點(diǎn),第一個(gè)酶活性位點(diǎn)正是第4號(hào)外顯子保守序列編碼區(qū)域。對(duì)不同油菜種進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所克隆的PEPC基因保守序列比較發(fā)現(xiàn),該保守序列高度一致,從甘藍(lán)型油菜F008中克隆的序列與NCBI公布序列完全一致,白菜型油菜與芥菜型油菜,該序列同源性達(dá)96％以上。同時(shí),利用PCR擴(kuò)增油菜種子儲(chǔ)存蛋白啟動(dòng)子Napin,比對(duì)該啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)功能調(diào)控元件都存在,與NCBI公布序列相似度達(dá)98％,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄功能正常。
　　 2.利用從甘藍(lán)型油菜中所

7、克隆的啟動(dòng)子以及PEPC基因保守序列(酶活性位點(diǎn)序列)構(gòu)建了RNA干擾表達(dá)載體pCAMNapin-B1-NEI-B2,以及pBI35S-B1-NEI-B2表達(dá)載體。在載體構(gòu)建過(guò)程中,測(cè)序發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在大腸桿菌的復(fù)制過(guò)程中回文序列容易被剪切,而且剪切是隨機(jī)的。通過(guò)反復(fù)連接,克隆實(shí)驗(yàn),最終獲得了一個(gè)與實(shí)驗(yàn)預(yù)期一致的ihpRNA載體結(jié)構(gòu),對(duì)該載體序列進(jìn)行甲基化測(cè)序發(fā)現(xiàn),該載體中存在2個(gè)甲基化位點(diǎn),甲基化作用保護(hù)載體序列在大腸桿菌中的復(fù)制過(guò)程被

8、剪切。分析發(fā)現(xiàn)甲基化位點(diǎn)處于中間載體部分,目標(biāo)片斷序列未出現(xiàn)甲基化,因此,該載體仍能在受體細(xì)胞中起到正常轉(zhuǎn)錄雙鏈RNA的作用。
　　 3.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Floral-dip和子葉、下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化方法,將質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜F008、Westar受體材料中,并對(duì)轉(zhuǎn)化后代植株進(jìn)行了抗性篩選、PCR特異擴(kuò)增,PCR-Southern,以及DNA測(cè)序分析鑒定。通過(guò)對(duì)Floral-dip轉(zhuǎn)化方法與子葉、下胚軸轉(zhuǎn)化方法的比較,發(fā)現(xiàn)F

9、loral-dip轉(zhuǎn)化方法效率較高,平均轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了0.69％,受基因型影響較小,轉(zhuǎn)化過(guò)程簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)、無(wú)需組織培養(yǎng);但抗性篩選過(guò)程繁瑣;子葉、下胚軸轉(zhuǎn)化效率較低分別是0.25％,0.15％,受基因型影響較大,操作過(guò)程復(fù)雜,周期較長(zhǎng)。
　　 4.用野生型植株與轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行熒光定量PCR比較分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株P(guān)EPC基因存在不同程度的表達(dá)抑制現(xiàn)象,開(kāi)花后10天,F008材料的平均抑制率達(dá)58.82％,平均抑制效果為61.5％;

10、Westar材料表達(dá)抑制率達(dá)到了83.33％,平均抑制效果為50％。開(kāi)花后25天,F008材料PEPC基因的平均表達(dá)抑制率23.53％,平均抑制效果為29.75％;Westar材料PEPC基因的平均表達(dá)抑制率達(dá)到了33.33％,平均抑制效果為58.5％。對(duì)T2代植株進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和甲基化檢測(cè),分析發(fā)現(xiàn),F008材料T2代植株共擴(kuò)增材料187株,陽(yáng)性植株128株,陽(yáng)性率68.50％;Westar材料T2代共擴(kuò)增植株144株,陽(yáng)性植株93

11、株,陽(yáng)性率64.58％,陽(yáng)性植株約占擴(kuò)增植株的2/3,符合一對(duì)基因的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律,并對(duì)T2代植株進(jìn)行基因組Southern blot分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株都為單拷貝插入。轉(zhuǎn)化植株與野生型植株進(jìn)行了PEPC基因甲基化檢測(cè),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株的甲基化率明顯提高,從增加2個(gè)位點(diǎn)到增加5個(gè)位點(diǎn)不等,說(shuō)明RNA干擾在一定程度上對(duì)目的基因DNA存在甲基化調(diào)控表達(dá)的作用,這可能與RNA抑制目的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。
　　 5.轉(zhuǎn)化植株與野生型植株進(jìn)

12、行了蛋白質(zhì)、含油率及脂肪酸成分分析,發(fā)現(xiàn)T1代轉(zhuǎn)基因植株,F008材料含油量平均提高2.41個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)提高5.97％,蛋白質(zhì)平均降低3.39個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)降低10.85％;Westar材料含油量平均提高1.51個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)提高3.72％;蛋白質(zhì)平均降低3.42個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)降低10.73％。T2代轉(zhuǎn)基因植株,F008材料含油量平均提高2.42個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)提高5.18％,蛋白質(zhì)平均降低2.23個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)降低8.35％;West

13、ar材料含油量平均增加2.1個(gè)百分點(diǎn),相對(duì)提高5.16％,蛋白質(zhì)平均降低1.34百分點(diǎn),相對(duì)降低4.81％。同時(shí),轉(zhuǎn)基因后代在脂肪酸成分上存在變化,T2代轉(zhuǎn)基因植株中,F008材料平均油酸含量比野生型植株高4.30個(gè)百分點(diǎn),最高提高了10.19個(gè)百分點(diǎn),亞油酸平均降低了2.89個(gè)百分點(diǎn),亞麻酸平均降低了1.20個(gè)百分點(diǎn);Westar材料油酸平均增加了2.15個(gè)百分點(diǎn),最高提高了5.87個(gè)百分點(diǎn),亞油酸降低了2.04個(gè)百分點(diǎn),亞麻酸降低了