腸道菌群在非酒精性脂肪性肝病中的變化及其與脂聯(lián)素DNA甲基化關(guān)系的探討性研究.pdf

1、目的：
　　1、通過5種不同的處理方法擬構(gòu)建5組不同腸道菌群狀態(tài)的大鼠模型，使用Illumina高通量測序技術(shù)對各組模型腸道菌群的結(jié)構(gòu)特點進行分析，研究腸道微生態(tài)與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)病變的關(guān)聯(lián)及其在疾病中的作用。
　　2、使用焦磷酸測序技術(shù)測定各組大鼠脂聯(lián)素基因DNA啟動子區(qū)甲基化水平，并與腸道微生態(tài)的關(guān)系進行探討性分析，研究腸道菌群是否通過影響脂聯(lián)素基因DNA啟動子區(qū)甲基化表達水平，引起低脂聯(lián)素血癥，從而導(dǎo)致

2、NAFLD的發(fā)生。
　　方法：50只雄性SD大鼠隨機分為5組，分別為正常普通飼料組（A組）、正常高脂飼料組（B組）、紊亂普通飼料組（C組）、紊亂高脂飼料組（D組）、紊亂高脂飼料培菲康組（E組），每組10只，其中后3組使用高劑量抗生素頭孢曲松溶液灌胃，建立腸道菌群紊亂模型，C組飼以普通飼料、D組為高脂飼料、E組高脂飼料喂養(yǎng)同時使用益生菌灌胃，且在喂養(yǎng)期間，繼續(xù)飲用低濃度頭孢曲松溶液以保持腸道菌群失調(diào)狀態(tài)；前2組生理鹽水灌胃，作為腸道

3、菌群正常模型，分別飼以普通飼料、高脂飼料。13周后收集血、肝臟及盲腸粘膜等標(biāo)本，檢測血脂、肝功能指標(biāo)，行HE染色及massonran染色明確肝組織病變程度，采用ELISA法測定血清脂聯(lián)素水平，提取肝臟DNA行16rDNA焦磷酸測序測定肝臟APN啟動子區(qū)甲基化水平以及提取粘膜組織DNA行16S rDNA高通量Illumina測序檢測腸道微生態(tài)變化。
　　結(jié)果：高脂喂養(yǎng)的B、D、E組均能成功造模非酒精性脂肪性肝病大鼠，將檢測得到的各項

4、指標(biāo)分別進行組內(nèi)（A組與B組、C組與D組、D組與E組）及組間（A組與C組、B組與D組）對比得到以下結(jié)果：
　　1、大鼠體重、肝濕重及肝臟指數(shù):13周末對全部大鼠稱重，喂食高脂飼料的SD大鼠體型消瘦，體重輕，B、D組體重分別較正常飼料的A、C組體重下降,但肝重和肝指數(shù)顯著增加，且P<0.01。E組與D組、A組與C組及B組與D組相比，各項指標(biāo)均無明顯差異。
　　2、肝臟病理學(xué)變化:8周后，A組及C組普通飼料喂養(yǎng)大鼠肝臟細胞無脂肪

5、變性，B組、D組、E組喂養(yǎng)高脂飲食后出現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變性。13周后，各組大鼠肝臟HE染色顯示，正常普通飼料組（A組）肝結(jié)構(gòu)完整，肝細胞正常，胞內(nèi)未見脂滴浸潤。紊亂普通飼料組（C組）肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，僅見散在少量脂滴。正常高脂飼料組（B組）呈單純性 NAFLD改變，為小泡性脂肪變，少量炎細胞侵潤，紊亂高脂飼料組（D組）出現(xiàn)明顯的肝脂肪變性及炎細胞浸潤。紊亂高脂飼料培菲康組（E組）肝細胞脂肪變性及炎癥浸潤程度改善，多為小泡性脂肪變。Ma

6、sson染色顯示，D組部分大鼠肝臟匯管區(qū)纖維組織增生，周圍可見纖維間隔形成。
　　3、血清生化指標(biāo):NAFLD大鼠模型B、D、E組肝功能存在不同程度損傷，組內(nèi)比較的A組與B組以及C組與D組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。血清TC及血清D-LDL濃度，B組與D組分別比A組與C組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；血清HDL-C濃度，C組比A組、D組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余組別間無差異。各組血清TG濃度均無差異。
　　4、血清APN水平:各組

7、大鼠血清APN含量：除D組血清APN濃度明顯降低外，A組、B組、C組、E組均無明顯下降。組間比較中，B組與D組比較存在明顯差異。組內(nèi)比較中，C組與D組及D組與E組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、肝臟APN啟動子區(qū)甲基化水平:在APN啟動子區(qū)的10個檢測位點中，B組和D組NAFLD大鼠肝臟APN的甲基化程度存在明顯差異，在位點2、位點6、位點9等3個位點，D組甲基化水平高于B組，有統(tǒng)計學(xué)意義，而在其它7個CpG位點甲基化水平無明顯

8、差異，并且其它大鼠各組間在10個檢測位點中均無明顯差異。
　　6、腸道微生態(tài)變化:通過OTU及其豐度分析顯示，不同的處理條件會對大鼠腸道菌群造成不同的影響。未經(jīng)抗生素處理的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與經(jīng)抗生素處理大鼠的結(jié)構(gòu)顯著不同，高脂飲食與普通飲食的大鼠腸道菌群亦存在差異。通過OTU統(tǒng)計及OTU Rank曲線可知A、B組大鼠腸道菌群的豐富程度（以A組最為豐富）明顯比C、D、E組（D組減少最為明顯）高，提示抗生素的不利因素可以降低物種的多樣

9、性。OTU主成分分析顯示，A、B組和C、D、E組各自聚集，區(qū)分良好，說明各組大鼠的腸道菌群中物種組成相似性低，存在差異，其中A組與B組離散程度大，各占不同空間，說明樣品組成在無抗生素干預(yù)的情況下，高脂飲食對菌群的影響占主要地位，D組因有抗生素及高脂喂養(yǎng)的雙重作用，腸道菌群多樣性是所有組別中減少最嚴重的一組。在物種及其豐度分析中，發(fā)現(xiàn)在不同分類水平上，不同組間物種的構(gòu)成有其獨特的核心微生物，且不同物種在每個樣品中所占比例亦不相同。在樣品組

10、間顯著性差異分析中，使用統(tǒng)計學(xué)方法在門、屬、種分類等級上檢驗兩組樣品間微生物群落豐度的差異，篩選出導(dǎo)致兩組樣品組成差異的物種。結(jié)果顯示腸粘膜菌群在各分類水平上，高脂飲食、抗生素等對門水平的種類影響較少，但對物種的組成比例影響較大，主要表現(xiàn)為厚壁桿菌門/擬桿菌門的比值減小，而在屬水平，種類間變化則較大，主要的有益菌乳酸桿菌屬在組間比較中大部分存在差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義，而雙歧桿菌屬、埃希氏菌屬及腸球菌屬均無明顯改變。
　　7、腸道菌群

11、與脂聯(lián)素甲基化之間的相關(guān)性分析:選擇B組與D組中3個有差異位點的脂聯(lián)素甲基化率，并將它們與雙歧桿菌和腸球菌在屬水平的豐度比值(B/E值)進行線性相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者無明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1.高脂飲食和（或）抗生素建立的各組大鼠模型存在腸道菌群多樣性的改變，表現(xiàn)為物種結(jié)構(gòu)的減少及物種豐富程度的下降兩個方面。
　　2.腸道菌群的變化與NAFLD的形成存在明顯的相關(guān)性，腸道菌群多樣性變化越大，NAFLD的脂肪變及炎癥