缺血再灌注大鼠腎組織及尿DcR2的變化與腎損害慢性化的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床上常見(jiàn)的危重疾病。DcR2作為腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的受體之一，具有凋亡抵抗作用。同時(shí)，DcR2也可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志，在腫瘤細(xì)胞和衰老的成纖維細(xì)胞以及體外高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干預(yù)DcR2表達(dá)，肝

2、臟纖維化程度減輕，提示DcR2可能在纖維化進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，DcR2作為跨膜受體，其胞外段可被蛋白酶剪切形成具有生物功能活性的可溶性分子，因此DcR2可在血清中檢測(cè)到。然而，截至目前DcR2在缺血再灌注大鼠腎組織和尿液中的表達(dá)水平以及與腎組織慢性化之間的關(guān)系尚無(wú)研究報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)主要包括以下三方面，首先為缺血再灌注大鼠腎組織DcR2表達(dá)及uDcR2/Cr水平與腎功能及腎組織慢性評(píng)分的相關(guān)性分析;其次，缺血再灌注大鼠

3、腎組織中DcR2與腎間質(zhì)纖維化標(biāo)志物α-SMA、CollagenⅣ的關(guān)系;最后，缺血再灌注大鼠腎組織中DcR2與衰老標(biāo)志物SA-β-gal、P16Ink4a的關(guān)系。
　　方法：
　　1.構(gòu)建輕、重度I/R大鼠腎損傷模型
　　隨機(jī)選取健康雄性SD大鼠，用無(wú)損動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂制備大鼠缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷模型。輕度損傷(I/R45min)和重度損傷（I/R60min）模型分別夾

4、閉45min、60min后放開(kāi)雙側(cè)動(dòng)脈夾給予腎臟再灌注。假手術(shù)(sham)模型，僅分離雙側(cè)腎蒂但不用動(dòng)脈夾夾閉，其它操作步驟與I/R組相同。
　　2.檢測(cè)兩組I/R大鼠腎功能
　　制備I/R大鼠腎損傷模型后，分別于術(shù)后1、3、7、21、35天收集雙側(cè)腎組織，腹主動(dòng)脈穿刺采集血液2ml，代謝籠收集24小時(shí)尿液。檢測(cè)各組血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿NAG酶水平。
　　3.兩組I/R大鼠腎組織慢性化

5、評(píng)分
　　隨機(jī)選取腎組織皮髓交界區(qū)域10個(gè)不連續(xù)的視野，計(jì)算炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化面積的比例：0分，無(wú)損傷;1分，＜25％;2分，25％～50％;3分，51％～75％;4分＞75。
　　4.免疫組化檢測(cè)兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)
　　選取待檢測(cè)的大鼠腎組織蠟塊，石蠟切片（厚度2μm），常規(guī)脫蠟、水化后行免疫組化檢測(cè)腎組織DcR2表達(dá)。在高倍顯微鏡，200倍視野下計(jì)數(shù)，每個(gè)腎組織隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)的

6、視野。鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)被染成棕色即為DcR2陽(yáng)性。計(jì)算DcR2陽(yáng)性區(qū)域面積占總面積的比例，0分：0％～5％;1分：6％～25％;2分：26％～50％;3分：51％～75％;4分：≥76％[10]。
　　5.ELISA檢測(cè)兩組I/R大鼠uDcR2/Cr水平
　　制備I/R大鼠腎損傷模型，分別于術(shù)后1、3、7、21、35天使用代謝籠收集24小時(shí)尿液，3000rpm/分鐘離心20-30分鐘，吸取上層血清。酶聯(lián)免疫吸附法(ELI SA

7、)檢測(cè)尿DcR2(uDcR2)水平并使用尿肌酐校正，結(jié)果以u(píng)DcR2/Cr表示。
　　6.兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)量及uDcR2/Cr水平與腎功能及腎組織慢性化評(píng)分的相關(guān)性分析
　　腎組織DcR2的表達(dá)及uDcR2水平與腎功能及腎組織慢性化評(píng)分的相關(guān)性使用spearman統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法。
　　7.免疫熒光共染檢測(cè)I/R60min大鼠腎組織DcR2與纖維化標(biāo)志的表達(dá)關(guān)系
　　(1)免疫熒光共染檢測(cè)缺血再灌注

8、7天后兩組I/R大鼠模型腎組織DcR2與纖維化指標(biāo)α-SMA和CollagenⅣ的共表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分。使用高倍顯微鏡，在200倍視野下，隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用雙盲法，由兩名醫(yī)師共同實(shí)施。計(jì)算α-SMA和CollagenⅣ陽(yáng)性區(qū)域面積：0分，無(wú);1分，＜25％;2分，25％～50％;3分，51％～75％;4分，＞75％[10]。
　　(2)使用spearman分析I/R大鼠

9、腎組織DcR2表達(dá)量與腎間質(zhì)纖維化程度的關(guān)系。
　　8.免疫化學(xué)染色檢測(cè)I/R60min大鼠腎組織DcR2與衰老標(biāo)志的表達(dá)關(guān)系
　　(1)免疫組化和SA-β-Gal染色檢測(cè)腎組織DcR2與SA-β-Gal的共表達(dá)情況。高倍顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)呈DcR2和SA-β-Gal雙陽(yáng)性表達(dá)的腎小管的比例。
　　(2)免疫熒光共染檢測(cè)腎組織DcR2和P16Ink4a共表達(dá)情況。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)呈DcR2和P16I

10、nk4a雙陽(yáng)性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.兩組I/R大鼠腎功能變化
　　I/R45min及I/R60min大鼠Scr、uNAG/Cr水平顯著高于Sham組。I/R45min大鼠再灌注1天后Scr水平到達(dá)峰值后逐漸下降，35天時(shí)Scr水平已降至正常(P＞0.05)。I/R60min大鼠各時(shí)間點(diǎn)Scr水平均顯著高于I/R45min，再灌注3天Scr水平到達(dá)峰值后逐漸下降，但35天時(shí)仍有80％的大鼠Scr

11、未恢復(fù)正常。uNAG/Cr變化與Scr基本相同，I/R45min大鼠uNAG/Cr再灌注1天后逐漸恢復(fù)正常，而I/R60min大鼠再灌注35天uNAG/Cr仍高于正常水平(P＜0.05)。
　　2.兩組I/R大鼠腎組織慢性化評(píng)分
　　缺血再灌注后皮髓交界區(qū)域出現(xiàn)廣泛的腎小管壞死、脫落等急性病理?yè)p傷表現(xiàn)。與Sham組（0分）相比，再灌注35天I/R45min大鼠腎組織基本恢復(fù)正常，腎組織慢性化評(píng)分為(3.67±0.58)分。I

12、/R60min與I/R45min相比，病理?yè)p傷程度明顯加重，并在35天可觀察到30％以上區(qū)域出現(xiàn)腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化等慢性化表現(xiàn)，腎組織慢性化評(píng)分為(8.33±1.29)分。
　　3.兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達(dá)與分布
　　DcR2僅在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，正常腎組織DcR2低表達(dá)。I/R45min大鼠再灌注1天腎組織DcR2表達(dá)量到達(dá)峰值，隨后逐漸下降，再灌注35天DcR2表達(dá)量與Sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞

13、0.05)。I/R60min大鼠DcR2表達(dá)量明顯高于I/R45min，再灌注3天到達(dá)峰值后逐漸下降，但35天時(shí)仍有大量DcR2表達(dá)，與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DcR2高表達(dá)主要見(jiàn)于修復(fù)不良的區(qū)域，而DcR2低表達(dá)部位腎組織修復(fù)良好。
　　4.兩組I/R大鼠uDcR2/Cr水平
　　Sham組uDcR2水平低下，缺血再灌注后uDcR2水平顯著升高。I/R45min組大鼠再灌注后第1天uDcR2水平明

14、顯升高并到達(dá)峰值，后隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)uDcR2/Cr水平逐漸降低，再灌注第35天時(shí)uDcR2/Cr水平降至正常(P＞0.05)。I/R60min大鼠再灌注第3天uDcR2水平到達(dá)峰值，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)uDcR2水平逐漸降低但仍明顯高于Sham組(P＜0.05)。
　　5.兩組I/R大鼠腎組織及尿液DcR2變化與腎功能及組織慢性化評(píng)分的相關(guān)性分析
　　I/R45min、I/R60min大鼠腎組織DcR2表達(dá)量與Scr、uNA

15、G/Cr及腎組織慢性化評(píng)分呈正相關(guān)，I/R45min相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.913、0.829(P＜0.05);I/R60min相關(guān)系數(shù)分別為0.857、0.909、0.851(P＜0.05)。
　　I/R45min、I/R60min大鼠uDcR2/Cr水平與Scr、uNAG/Cr及腎組織慢性化評(píng)分呈正相關(guān)，I/R45min相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.943、0.886(P＜0.05);I/R60min相關(guān)系數(shù)分別為0.9

16、20、0.847、0.827(P＜0.05)。
　　6.I/R60min大鼠腎組織DcR2與腎小管間質(zhì)纖維化標(biāo)志的關(guān)系
　　I/R60min大鼠再灌注21、35天可見(jiàn)DcR2陽(yáng)性腎小管及陽(yáng)性區(qū)域高表達(dá)α-SMA和CollagenⅣ，DcR2與腎小管間質(zhì)纖維化標(biāo)志α-SMA和CollagenⅣ的表達(dá)成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.885、0.806(P＜0.05)。提示DcR2與缺血再灌注后腎組織慢性化有關(guān)。
　　7.I/R

17、60min大鼠腎組織DcR2與衰老標(biāo)志的關(guān)系
　　免疫化學(xué)染色結(jié)果示，I/R60min組大鼠腎組織SA-β-gal、P16Ink4a隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，并且85％以上的DcR2陽(yáng)性腎小管高表達(dá)SA-β-gal、P16Ink4a。提示DcR2陽(yáng)性的腎小管上皮細(xì)胞具有衰老表型。
　　結(jié)論：
　　本研究證實(shí)了輕、重度缺血在灌注損傷模型中腎組織DcR2的表達(dá)與腎組織慢性化以及與腎小管細(xì)胞衰老密切相關(guān)，表明了DcR2可能