以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域為靶點的新型咪唑類化合物的抗菌效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　本課題組前期采用分子對接的方法，篩選出以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域為作用靶點的咪唑類化合物6，其在體外展示出較好的抗菌活性，但其體內(nèi)保護效果不理想，且細胞毒性較高。本研究擬以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域（CA結(jié)構(gòu)域）三維結(jié)構(gòu)中氨基酸功能殘基為藥物作用靶點，采用化合物6為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板，設(shè)計并合成一系列新型咪唑類抗菌化合物。通過化合物和三種不同的WalK蛋白相互作用，驗證新型化合物抗菌靶點

2、位于肺炎鏈球菌WalK酶CA結(jié)構(gòu)域；通過體外實驗考查化合物抗菌活性及毒性反應(yīng)；通過建立小鼠肺炎鏈球菌感染模型，檢測其體內(nèi)抗菌效應(yīng)。本研究擬最終獲得毒性小、體內(nèi)抗菌活性高、可能具有廣譜抗革蘭陽性菌的新型抗菌藥物。
　　方法:
　　本課題擬通過分子設(shè)計—合成—生物活性測試模式，采用活性基團拼接法和取代法，合成一系列新型咪唑類抗菌藥物；再對合成的咪唑類抗菌藥物進行元素、1H NMR、13C NMR、MS(ESI)、熔點、遠紅外光譜

3、等表征分析。利用PCR法擴增3種不同肺炎鏈球菌WalK基因序列（全長、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域），并構(gòu)建3種WalK基因序列的重組ppSUMO質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，依靠IPTG誘導(dǎo)表達及Ni-NTA親和層析，得到純度較高的可溶性目的蛋白；利用該蛋白免疫BALB/C小鼠獲取多克隆抗體，經(jīng)ELISA法檢測其特異性IgG抗體效價，經(jīng)Western Blot鑒定WalK全長蛋白在4種S.pn血清型菌株中的保守性。利

4、用ATP激酶發(fā)光檢測試劑盒檢測以上三種蛋白的激酶活性，檢測蛋白與新型咪唑類化合物作用后的激酶活性變化（IC50）。通過最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）及細胞毒性試驗（MTT法）等實驗評價化合物的體外抗菌效應(yīng)以及細胞毒性作用。構(gòu)建BALB/C小鼠的腹腔S.pn感染模型，通過尾靜脈注射途徑給藥，觀察小鼠的生存時間和生存率。
　　結(jié)果：
　　本課題組前期已經(jīng)成功合成以原始化合物6為母體的15種新型咪唑類化合物，并對其

5、中的6種化合物進行了1H NMR、13C NMR、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜、熔點等結(jié)構(gòu)和組成表征分析，結(jié)果提示為預(yù)期目標分子。成功構(gòu)建和表達WalK（全長、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域）重組蛋白；以全長WalK蛋白免疫小鼠后獲得高滴度的多克隆抗體，Western Blot分析證實，CMCC(B)31207、CMCC(B)31203、CMCC(B)31693、NTCC7466(D39)等4種S.pn菌株均能穩(wěn)定的表達WalK全長蛋白。隨著

6、新型咪唑類化合物（2號、4號及5號）藥物濃度的逐漸增高，WalK全長組和僅含有CA結(jié)構(gòu)域組ATP激酶活性均持續(xù)降低（均P<0.05）；而不同濃度的新型咪唑類化合物（2號、4號及5號）與缺陷CA結(jié)構(gòu)域組作用，其ATP激酶活性變化無明顯差異（P>0.05）。通過最小抑菌濃度、最小殺菌濃度等體外實驗證實，新合成咪唑類化合物2號、4號、5號均具有較好的抑菌及殺菌效應(yīng)，其中4號化合物抑菌及殺菌效果最為明顯（P<0.01）；細胞毒性試驗證實，三種化

7、合物細胞毒性均顯著低于原始化合物（P<0.01），其中以2號細胞毒性最低(1170μM)。化合物對腹腔感染D39型肺炎鏈球菌小鼠的治療效果證實，與陽性對照組（PNC組）比較，原始化合物6號、新合成咪唑類化合物4號、5號的保護效果均未見明顯差異（均P>0.05）；2號化合物與陽性對照組間比較其保護效果明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　WalK全長重組蛋白在不同血清型S.pn中保守性較好，新合成咪唑類化合物（2號、4號

8、及5號）具有抑制WalK酶CA結(jié)構(gòu)域ATP激酶活性的效應(yīng)；最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗均證實4號化合物在體外具有極佳的抗菌及殺菌效應(yīng)；細胞毒性實驗證實以2號、4號、5號化合物細胞毒性均顯著低于原始化合物；體內(nèi)抗菌效應(yīng)試驗提示新合成的咪唑類化合物4號、5號均能夠明顯延長腹腔感染肺炎鏈球菌D39小鼠的生存時間。
　　本研究首次證實新合成的4號咪唑類化合物可能是未來治療肺炎鏈球菌感染的新型藥物，后續(xù)實驗將著重其藥物代謝學(xué)、藥物動力學(xué)方