Sirt6對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機制研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Sirt6對多壁碳納米管和TGF-β1誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用
　　目的：Sirt6是組蛋白去乙酰化酶Ⅲ家族的一員，在代謝、衰老、癌癥等人體重要的生理過程中發(fā)揮重要作用，但Sirt6是否調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial to mesenchymal transition,EMT）表型尚不清楚。
　　方法：雄性C57BL小鼠分為三組（空白對照組、多壁碳納米管（Multi-

2、walled carbon nanotube,MWCNT）組和博萊霉素組），每組10只小鼠。分別注射50μl生理鹽水或60μg MWCNT處理56天或2mg/kg博來霉素處理21天后，取肺組織進行免疫組化（Immunohistochemisty,IHC）染色和Western blot檢測Sirt6的表達。A549細胞過表達Sirt6后使用16μg/cm2MWCNT或5ng/ml TGF-β1（Transformed growth fac

3、tor-beta1）處理細胞24小時，采用Western blot、Real-time PCR和免疫熒光檢測EMT標志物E-cadherin、vimentin和α-SMA的表達。采用Western blot和Real-time PCR檢測纖維化標志物FN、CTGF蛋白和mRNA的表達。此外，通過Transwell實驗檢測A549細胞的遷移能力改變。
　　結(jié)果：（1）在MWCNT和博來霉素誘導的肺纖維化模型中，IHC染色和Weste

4、rn blot檢測發(fā)現(xiàn)Sirt6表達上調(diào)（P<0.05）；（2）過表達Sirt6可以逆轉(zhuǎn)MWCNT和TGF-β1誘導的EMT表型（P<0.05）；（3）過表達Sirt6顯著抑制TGF-β1誘導的FN和CTGF蛋白和mRNA的表達（P<0.05）。同時A549細胞羥脯氨酸的分泌和細胞遷移能力受到抑制（P<0.05）。
　　結(jié)論：過表達Sirt6可以顯著抑制MWCNT和TGF-β1誘導的EMT表型和TGF-β1誘導的間質(zhì)細胞學行為。<

5、br>　　第二部分 過表達Sirt6對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控的機制研究
　　目的：進一步研究過表達Sirt6對EMT的調(diào)控機制。
　　方法：在A549細胞中過表達Sirt6，使用5ng/ml TGF-β1刺激60分鐘或者24小時。通過Western blot檢測TGF-β/Smads通路分子的表達變化。免疫熒光技術(shù)檢測Smad3的核轉(zhuǎn)位和與Sirt6的共定位。免疫共沉淀分別檢測Sirt6與Smad3或者與snail1結(jié)合情況以及S

6、mad3和snail1的結(jié)合變化。Real-time PCR檢測EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（snail1、slug、twist1、ZEB1和ZEB2）mRNA的表達變化。
　　結(jié)果：（1）過表達Sirt6顯著削弱TGF-β1的蛋白表達（P<0.05），但對Smad2、Smad3和Smad4蛋白表達無影響；（2）過表達Sirt6顯著抑制Smad3磷酸化以及核轉(zhuǎn)位（P<0.05），但對Smad2磷酸化沒有影響；（3）隨著TGF-β1刺激時間增

7、加，Sirt6與Smad3或snail1的結(jié)合也隨之增加。此外，過表達Sirt6阻礙TGF-β1誘導的snail1和Smad3的結(jié)合；（4）過表達Sirt6顯著抑制TGF-β1誘導的EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達（P<0.05或P<0.01）。
　　結(jié)論：Sirt6可能通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路調(diào)節(jié)EMT表型；Sirt6抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可能是其調(diào)控EMT的一種機制。
　　第三部分 肺靶向過表達Sirt6削弱博來

8、霉素誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺纖維化
　　目的：動物體內(nèi)進一步驗證Sirt6對EMT的調(diào)控作用。
　　方法：C57BL小鼠分為四組（對照組、Sirt6過表達組、對照+博萊霉素組和Sirt6過表達+博萊霉素組），每組15只小鼠。每只小鼠肺部注射2×1011vg Sirt6腺相關(guān)病毒一周后，經(jīng)氣管插管注射2mg/kg的博來霉素，21天后取肺組織做蘇木精-伊紅染色、Masson、IHC和免疫熒光染色。
　　結(jié)果：（1）肺組織過表