大豆磷脂對凋亡相關(guān)基因及抗氧化能力的影響.pdf

1、磷脂是一種純天然的營養(yǎng)保健品,主要存在于動、植物的細胞中,是細胞膜的主要組成成分。大豆磷脂可以維持生物膜正常的結(jié)構(gòu)與功能,與細胞的生長、增殖、分化、癌變緊密聯(lián)系,其降解產(chǎn)物還參與細胞的信號轉(zhuǎn)導、代謝調(diào)控,具有改善記憶、延緩衰老、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、健腦等多種生理作用。因此本實驗研究大豆磷脂對學習記憶相關(guān)基因及抗氧化能力的影響,并探討其作用機制,為大豆磷脂更好的應用提供實驗依據(jù),進而對神經(jīng)細胞的保護作用等方面提供新的思路。
　　 實

2、驗方法:
　　 1.建立D-半乳糖致衰大鼠模型,將50只SD雄性大鼠按體重隨機均分成5組,即正常對照組、模型對照組、大豆磷脂低劑量組(0.5 g／kg／d)、中劑量組(1.0 g／kg／d)、高劑量組(1.5 g／kg／d)。模型對照組、大豆磷脂組皮下注射D-半乳糖50 mg／kg／d,正常對照組注射等量生理鹽水。每天定時灌胃和注射各1次。第30 d測學習記憶,第45 d處死大鼠,取各組織分別測定MDA含量、SOD和CAT活力。

3、
　　 2.建立D-半乳糖致衰大鼠模型,第45 d處死大鼠,提取海馬和大腦皮層中總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法,定量檢測其海馬和皮層中Bax、p53、Bcl-2、c-fos、NCAM的基因表達。
　　 3.體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞。取出生24 h內(nèi)小鼠,75％酒精消毒,取大腦,剔除腦膜和血管,剪成1mm3小塊,0.125％胰蛋白酶37℃消化20 min,終止消化后1000 r／min離心5 min,取沉淀,

4、制成細胞懸液,細胞計數(shù)并調(diào)整密度至2×106個／mL,接種入經(jīng)0.1％L-多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)板內(nèi),置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h后全量換液,接種3 d后,再次全量換液,加入含不同濃度大豆磷脂的完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)6 d后即做下一步實驗。MTT法和臺盼藍法檢測細胞活力,收集細胞,分別測定蛋白質(zhì)總含量、MDA含量和CAT活性。
　　 4.體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞。在倒置顯微鏡下觀察不同時期神經(jīng)細胞的形態(tài)變化

5、,細胞培養(yǎng)6 d后,通過.AO／EB熒光染色、Hoechst 33258熒光染色、單細胞凝膠電泳觀察細胞結(jié)構(gòu),掃描電鏡觀察細胞表面超微結(jié)構(gòu)。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.與正常對照組相比,致衰大鼠學習記憶能力顯著下降(P<0.05),各組織中MDA含量顯著增加,SOD、CAT活性明顯減弱(P<0.05)；與模型對照組相比,大豆磷脂組的大鼠學習記憶能力明顯提高(P<0.05),各組織中MDA含量顯著減少,SOD、CAT活性

6、顯著增強(P<0.05),表明本實驗已成功建立D-半乳糖致衰模型,且大豆磷脂具有增強學習記憶力和提高抗氧化能力。
　　 2.與正常對照組相比,模型對照組Bax／β-actin與p53／β-actin的比值均增大,差異極顯著(P<0.01)；Bcl-2／β-actin與NCAM／β-actin的比值均減小,差異極顯著(P<0.01)；c-fos／β-actin的比值增大無顯著性(P>0.05)。與模型對照組相比,大豆磷脂組Bax／

7、β-actin的比值顯著減小(P<0.05).p53／β-actin的比值有減小的趨勢(P>0.05)；Bcl-2／β-actin與NCAM／β-actin的比值均增大,差異極明顯(P<0.01)；c-fos／β-actin的比值極顯著減小(P<0.01)。實驗表明,大豆磷脂可以降低致衰大鼠海馬和皮層組織中Bax、p53、c-fos基因表達,提高Bcl-2、NCAM基因表達。
　　 3.MTT染色法結(jié)果顯示,與正常對照組相比,大

8、豆磷脂10-7mg／mL-10-5mg／mL組神經(jīng)細胞活力增強,并且隨著大豆磷脂濃度的增大,神經(jīng)細胞活力逐漸增強,大豆磷脂10-5 mg／mL組與正常對照組之間差異顯著(P<0.05),但是大豆磷脂10-5mg／mL-10-3mg／mL組中神經(jīng)細胞活力減弱,且大豆磷脂10-3mg／mL組的細胞活力略低于正常對照組,說明大豆磷脂的濃度并不是越高越好,而是應該控制在一定的濃度范圍內(nèi)。臺盼藍染色結(jié)果顯示各組之間神經(jīng)細胞存活率差異不顯著(P>0

9、.05)。神經(jīng)細胞中蛋白質(zhì)總含量和MDA含量均無明顯差異(P>0.05),CAT活性有增強的趨勢(P>0.05)。實驗表明,大豆磷脂對神經(jīng)細胞的抗氧化能力有一定的促進作用。
　　 4.倒置顯微鏡下,細胞接種4 h開始貼壁,分布均勻,細胞圓并透明；培養(yǎng)24 h后,細胞絕大部分呈梭形,細胞呈立體隆起狀,表面光滑,細胞有單極突起出現(xiàn),少數(shù)細胞還有雙極突起出現(xiàn)；培養(yǎng)3 d后,細胞主要呈梭形形態(tài),且胞體飽滿,細胞突起增多、增長,雙極和多極

10、突起明顯增多,光暈明顯,細胞之間開始形成完整的神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)6 d后,細胞呈梭形、三角形等多種形態(tài),胞體明顯增大,突起增粗,增長,突起數(shù)量增多。經(jīng)AO／EB熒光染色后,正常對照組與大豆磷脂組均呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征,核染色質(zhì)著綠色且細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示,正常對照組和大豆磷脂組細胞核形態(tài)均規(guī)則,呈現(xiàn)均一的弱藍色熒光,結(jié)構(gòu)正常。單細胞凝膠電泳中,正常對照組與大豆磷脂組均沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。且Hoe

11、chst 33258染色和單細胞凝膠電泳結(jié)果均顯示大豆磷脂能增加神經(jīng)細胞密度。掃描電鏡中,大豆磷脂組神經(jīng)細胞表面皺褶豐富,突起數(shù)量多,雙極或者多極分化清楚,相互間呈網(wǎng)狀。實驗表明,一定濃度的大豆磷脂可以維持神經(jīng)細胞的正常結(jié)構(gòu),提高神經(jīng)細胞的密度,且有促進神經(jīng)細胞突起分化、增長的功能。
　　 結(jié)論:
　　 1.大豆磷脂具有增強記憶和延緩衰老的作用,可以緩解或部分緩解由D-半乳糖對大鼠的致衰作用。
　　 2.大豆磷脂