L-賴氨酸對銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa抑制作用的研究.pdf

1、水體富營養(yǎng)化引發(fā)了藍藻大面積爆發(fā)性繁殖，嚴重影響著水域生態(tài)系統(tǒng)，威脅人類的健康生活，控制藍藻的生長是治理水體富營養(yǎng)化過程中亟待解決的問題。L-賴氨酸是微生物生長的必需氨基酸之一，對微囊藻具有顯著的抑制效果。本論文以水華藻銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為研究對象，考察L-賴氨酸對M.aeruginosa的影響，并研究L-賴氨酸的作用機理。通過對M.aeruginosa NaRes975進行全基因組測序，篩選參與

2、胞外多糖合成和第二信使環(huán)二鳥苷酸代謝的基因，進行轉錄活性及蛋白表達研究，探索藻細胞應答L-賴氨酸作用的分子調控機制。主要研究內容和結果如下:
　　(1)從細胞形態(tài)結構、生理、代謝、分子調控多方面考察L-賴氨酸對M.aeruginosa的影響。研究結果表明，當濃度≥5.0mg/L時，L-賴氨酸對M.aeruginosa抑制效果顯著，但M.aeruginosa FACHB-905比M.aeruginosaNaRes975需要更長的處理

3、時間。在作用時間長于2天、濃度＞0.5mg/L時，L一賴氨酸能夠抑制蛋白質和葉綠素a的積累，破壞細胞的光合作用系統(tǒng)。在3.0-8.0mg/L L-賴氨酸作用1天時，O2-、MDA含量和SOD活性增加，表明L-賴氨酸可能會誘導藍藻細胞發(fā)生嚴重的氧化應激反應。此外，L-賴氨酸可促進M.aeruginosa NaRes975多糖的合成。同時，3.0mg/L L一賴氨酸處理3天后，多糖合成酶基因的轉錄活性上調。這些結果表明微囊藻細胞啟用不同機制

4、抵抗L-賴氨酸帶來的損傷。當L-賴氨酸的濃度高于3mg/L、作用3天后，M.aeruginosa細胞形態(tài)被嚴重破壞。此外，L-賴氨酸對不同藻種作用效果表明，L-賴氨酸對銅綠微囊藻和魚腥藻具有較好的抑制效果，藻株不同抑制效果不同。用L-賴氨酸處理產藻毒素藻株M.aeruginosa FACHB-905，當L一賴氨酸濃度為3.0mg/L時既能抑制藻細胞生長又能降低胞外藻毒素的生成。
　　(2)M.aeruginosa NaRes975

5、全基因組的測序?；蚪M測序采用二代測序Illumina平臺完成，測序結果已上傳至GenBank，檢索號為MOLN00000000。測序結果表明，M.aeruginosa FACHB-905基因組大小為5，117，533bp，G+C含量為42.4％，可預測到的編碼基因個數為5，152。
　　(3)多糖合成酶基因和環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)代謝酶基因的克隆及異源表達。本文通過PCR擴增技術分別對多糖合成酶基因及環(huán)二鳥苷酸代謝酶基因

6、進行克隆，以pET-32a(+)為載體成功構建了重組質粒，并在Escherichia coli BL21(DE3)和Rosetta gamiTM2(DE3)plysS中進行異源表達。SDS-PAGE結果顯示，多糖合成酶基因在不同的IPTG濃度和培養(yǎng)溫度下未成功誘導表達目的蛋白。c-di-GMP代謝酶基因在大腸桿菌中表達經過IPTG濃度、溫度和誘導時間的優(yōu)化，所表達出的蛋白仍然是以包涵體的形式存在于細胞破碎沉淀中。
　　綜上所述，本