三帶喙庫蚊種群特征及感染流行性乙型腦炎病毒的研究.pdf

1、流行性乙型腦炎（Japanese Encephalitis,JE），簡稱乙腦，是一種重要的蚊媒傳染病，其傳播媒介主要是三帶喙庫蚊（Culex tritaeniorhynchus），病原體是日本腦炎病毒（Japanese Encephatlitis virus,JEV），主要感染兒童和青少年，病死率可達(dá)10％以上，一半以上的幸存者會留下神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，是人類健康的嚴(yán)重威脅。另外，乙腦病毒也容易造成受感染的母豬流產(chǎn)或畸胎，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。<

2、br>　　為闡明三帶喙庫蚊種群特征及感染流行性乙型腦炎病毒特點(diǎn)，從而科學(xué)有效地防控流行性乙型腦炎，本研究主要從生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)、群體遺傳學(xué)等角度開展了三方面研究：
　　1.流行性乙型腦炎主要媒介三帶喙庫蚊種群分布特征研究。
　　在江蘇省長江入?？趦砂哆x擇啟東市和太倉市作為調(diào)查地點(diǎn)，調(diào)查以雞、豬為誘餌的蚊蟲種類構(gòu)成和三帶喙庫蚊種群數(shù)量季節(jié)變化，同時調(diào)查三帶喙庫蚊在農(nóng)村豬圈、民居和草地等生態(tài)環(huán)境的種群分布。通過收集江蘇省病媒生

3、物監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)中2009年-2015年蚊蟲監(jiān)測數(shù)據(jù)，對三帶喙庫蚊在城市城區(qū)范圍內(nèi)公園、居民區(qū)和醫(yī)院不同生境分布和動態(tài)變化進(jìn)行了分析。
　　研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三帶喙庫蚊以叮吸豬等家畜類血液為主，主要分布于豬圈、牛棚等生境，其次是民居，在江蘇每年從5月開始出現(xiàn)，然后密度逐漸升高，7-8月達(dá)到密度高峰，隨后密度逐漸下降，10月基本監(jiān)測不到該蚊種?；陔u為誘餌的三帶喙庫蚊種群數(shù)量較少，在江蘇主要出現(xiàn)在6-8月。研究同時發(fā)現(xiàn)，至少從2009年開始，

4、三帶喙庫蚊已經(jīng)在江蘇各市的城區(qū)范圍內(nèi)出現(xiàn)，主要分布于公園，居民區(qū)和醫(yī)院等場所分布相對較少，高峰主要出現(xiàn)在8月，這可能是由于農(nóng)村生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)模式改變造成生存壓力所致。
　　2.三帶喙庫蚊線粒體DNA和微衛(wèi)星特征分析。
　　采集三帶喙庫蚊標(biāo)本，提取基因組DNA，對線粒體全長進(jìn)行測序。從GenBank檢索下載5屬33種蚊蟲線粒體全長和COⅠ基因序列，與三帶喙庫蚊相應(yīng)序列構(gòu)成數(shù)據(jù)，探討線粒體DNA全長用于三帶喙庫蚊分子分類鑒定的可

5、行性和優(yōu)勢。本研究系首次對三帶喙庫蚊線粒體全長進(jìn)行了測序。通過構(gòu)建進(jìn)化樹，對線粒體全長和COⅠ基因用于三帶喙庫蚊分子分類鑒定進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)線粒體基因組全長可以用于三帶喙庫蚊分子分類鑒定，由于序列更長，含有更豐富的生物信息，相對于線粒體上COⅠ基因可以更細(xì)致的對蚊蟲種類進(jìn)行區(qū)分。
　　采集16個地理種群的三帶喙庫蚊，每個地理種群挑選5-6只蚊蟲，每只蚊蟲作為一個樣本提取DNA，設(shè)計引物擴(kuò)增線粒體ND4和ND5基因。分析發(fā)現(xiàn)，ND5

6、基因比ND4基因擁有更高比例的多態(tài)性位點(diǎn)和更多的單倍型數(shù)，相對更適合做種群進(jìn)化分析的分子標(biāo)記。三帶喙庫蚊ND4和ND5單倍型與地理位置無明顯對應(yīng)關(guān)系，種群間分化程度小。
　　采集20個地理種群的三帶喙庫蚊，每個地理種群挑選30只蚊蟲，每只蚊蟲作為一個樣本提取DNA，設(shè)計引物篩選出10個微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增后對微衛(wèi)星 DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行種群遺傳學(xué)分析。結(jié)果表明，本研究中單地點(diǎn)30次重復(fù)采樣能夠代表對應(yīng)地理種群的整體情況，20個地

7、理種群的觀察雜合度均低于預(yù)期雜合度，種群近交系數(shù)基本在0.1以上，10個位點(diǎn)群體間近交系數(shù)（0.141）大于群體內(nèi)近交系數(shù)（0.006），10個微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因流平均值為10.4703，64.7%的種群間成對固定指數(shù)Fst未表現(xiàn)出明顯的遺傳分化，這些參數(shù)結(jié)果表明三帶喙庫蚊種群間近交明顯，基因交流頻繁。
　　3.三帶喙庫蚊和宿主攜帶流行性乙型腦炎病毒和病毒基因組特征分析。
　　2015-2016年在江蘇省4個城市9個地點(diǎn)的豬圈

8、中以誘蚊燈法采集三帶喙庫蚊，其中連云港小高莊和新灘村在2015年和2016年分別在同一地點(diǎn)進(jìn)行了2次采集，其余地點(diǎn)均為2016年采集。以50只蚊蟲為一組，提取RNA，設(shè)計引物，RT-PCR法擴(kuò)增乙腦病毒核酸。結(jié)果顯示，乙腦病毒在三帶喙庫蚊中的感染比例較高，本研究中，陽性樣本份數(shù)比例基本在10%以上，近一半在50%以上，最高為泰州張家院村，達(dá)到了80%。最小感染率（IR）也有近一半在10%以上，最高為16.00‰，而最大似然估計值（MLE

9、）比相應(yīng)的最小感染率值都大，感染情況越嚴(yán)重，兩者的誤差越大。
　　2014年在江蘇省分別采集小葦鶼、小白鷺和池鷺血清樣本13、12和2份，提取核酸后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未檢測出乙腦病毒。2014年3-10月，每月在啟東和太倉分別采集幼豬和母豬血清標(biāo)本，以ELISA法檢測抗乙腦病毒IgG抗體，以乳膠凝集法檢測IgM抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬對乙腦病毒IgM和IgG抗體自6月開始升高，7-8月達(dá)到高峰，9月開始逐漸下降。將抗體陽性的血清標(biāo)本提取核酸

10、檢測乙腦病毒，未發(fā)現(xiàn)陽性。2014年4-9月，每月在屠宰場采集豬腦，提取核酸檢測乙腦病毒，結(jié)果在228份豬腦中均未檢出乙腦病毒核酸。
　　從三帶喙庫蚊每個地理種群乙腦病毒檢測陽性的標(biāo)本中挑選1-2份對乙腦病毒E基因進(jìn)行測序。2015-2016年共獲得17株乙腦病毒的E基因序列，其中2015年從連云港3地的三帶喙庫蚊中獲得4株乙腦病毒E基因序列，2016年從宿遷、南京、泰州和連云港的三帶喙庫蚊中獲得12株乙腦病毒的 E基因序列，從泰

11、州張家院十四組的中華按蚊中獲得1株乙腦病毒的E基因序列。根據(jù)E基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行基因分型，17株乙腦病毒在基因型上均屬于GⅠ-b型，氨基酸序列與減毒疫苗株SA14-14-2比較，抗原關(guān)鍵位點(diǎn)E332、E304和E335相同。17株乙腦病毒毒力關(guān)鍵位點(diǎn)E138和E176相同，但與SA14-14-2株不同，表明17株乙腦病毒與SA14-14-2株抗原性相似，但毒力可能強(qiáng)于SA14-14-2，這表明基于SA14-14-2的乙腦疫苗目前在江