成骨化羊ADSCs復(fù)合表面改性融合器構(gòu)建組織工程化骨的研究.pdf

1、目的：
　　當(dāng)今脊椎退行性疾病的發(fā)病率不斷上升。其治療方法主要包括脊柱融合和非融合技術(shù)。本研究在相關(guān)文獻(xiàn)報道基礎(chǔ)上，利用納米化β-磷酸三鈣/殼聚糖/聚己內(nèi)酯(β-TCP/CS/PCL)仿生椎間融合器和鈦金屬椎間融合器支架復(fù)合成骨化羊ADSCs來構(gòu)建組織工程化骨，測定其成骨潛能及細(xì)胞生物相容性，以驗證體外構(gòu)建組織工程骨的可行性，為今后臨床應(yīng)用建立理論及實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.羊脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取無菌山羊腹

2、部脂肪組織，0.1％I型膠原酶消化后以完全培養(yǎng)基原代培養(yǎng)，傳至第3代。凍存?zhèn)溆谩?br>　　2. ADSCs成骨方向誘導(dǎo)及分組：取第3代ADSCs，實驗組以含成骨誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組僅用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)14天后行堿性磷酸酶（ALP）染色，鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色，及骨鈣素表達(dá)以檢測成骨活性。
　　3.納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器和鈦金屬融合器的制備及表面改性：納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器分為兩組，A組

3、使用RGD多肽修飾，B組為未修飾組；鈦金屬融合器分為兩組，C組使用飛秒激光行表面納米級溝槽改性，D組為表面未改性組。
　　4.成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞接種于上述融合器復(fù)合培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后的第1、7、14、21天行掃描電鏡觀察，第1、4、7、10、13、16、19、22天行MTT細(xì)胞增殖及ALP定量檢測。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)24h后，ADSCs已沉降貼壁，形態(tài)不規(guī)則，多為圓型或多角型。72h后ADSCs已逐漸伸展為梭

4、形，體積增大，部分細(xì)胞有粗大突起。培養(yǎng)3代后，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈長梭狀，增生活躍。ADSCs成骨誘導(dǎo)后形態(tài)發(fā)生改變，由梭形變?yōu)槎嘟切?。成骨化鑒定ALP染色可見多數(shù)細(xì)胞核、胞質(zhì)內(nèi)染色呈陽性。茜素紅染色可見細(xì)胞之間有團(tuán)塊狀的鈣鹽沉積，呈深紅色或橘紅色結(jié)節(jié)，多個礦化結(jié)節(jié)可融合。實驗組較對照組骨鈣素有明顯升高，差異有顯著性意義。
　　2.四組融合器復(fù)合培養(yǎng)后掃描電鏡顯示，A、B組內(nèi)有大量細(xì)胞粘附，排列良好，完全伸展，A組相比B組細(xì)胞生長旺盛

5、。C組表面細(xì)胞粘附數(shù)量少，D組較C組細(xì)胞脫落更為明顯。A、B組較C組細(xì)胞增殖活躍。
　　3.A、B、C組前14天MTT結(jié)果及ALP酶活性均隨培養(yǎng)時間延續(xù)而遞增，后期細(xì)胞增殖速率緩慢。A、B兩組每個時間點OD值A(chǔ)LP酶活性均明顯高于C、D組，差異有顯著性意義（P<0.05）。A組每個時間點OD值及ALP酶活性均明顯高于B組，差異有顯著性意義（P<0.05）。C組每個時間點OD值及ALP酶活性均高于與D組，差異有顯著性意義（P<0.0

6、5）。
　　結(jié)論：
　　1.利用膠原酶消化、貼壁分離羊ADSCs，成骨誘導(dǎo)后經(jīng)檢測證實其成骨潛能。羊ADSCs可用于構(gòu)建脊柱組織工程的種子細(xì)胞。
　　2.成骨化ADSCs與納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器復(fù)合培養(yǎng)后，細(xì)胞在支架內(nèi)部生長良好，且分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，表明體外成功構(gòu)建了組織工程化骨，該構(gòu)建的復(fù)合物有應(yīng)用于臨床作為椎間融合器的可行性。RGD有利于種子細(xì)胞的粘附，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　3.成骨化ADS