辛溫通陽中藥蔥白提取物對動脈粥樣硬化大鼠IL-6-STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 通過辛溫通陽中藥和活血化瘀中藥、化痰中藥、通絡中藥、通下中藥治療動脈粥樣硬化的對比研究，探討辛溫通陽中藥蔥白提取物對動脈粥樣硬化大鼠IL-6/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用及機制研究，初步揭示辛溫通陽中藥治療AS的生物學基礎。
　　 方法：
　　 本研究選用健康純種SD雄性大白鼠，體重為200-230克，3-4月齡120只，隨機分為正常對照組、空白模型組、蔥白提取物組、薤白提取物組、桂枝提取物組、干姜

2、提取物組、附子提取物組、丹參提取物組、瓜蔞提取物組、地鱉蟲提取物組、大黃提取物組、普羅布考組，每組10只。參照郭延松等的方法制備動脈粥樣硬化模型。適應性喂養(yǎng)一周后，正常對照組喂基礎飼料和普通自來水，模型組及各治療組以高脂飼料(2％膽固醇、0.5％膽酸鈉、3％豬油、0.2％丙基硫氧嘧啶和94.3％的基礎飼料)和維生素D3粉劑(1.25×106u/kg)喂養(yǎng)。并于實驗開始時于右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105u/kg體重)，以后每隔3

3、0天重復注射一次。于第7天除正常對照組外，其余各組行大鼠主動脈內(nèi)膜球囊損傷術(shù)于造模后第3天開始給藥，給藥體積為2ml/kg，正常對照組和空白模型組給予生理鹽水。蔥白提取物組按20mg.kg-1給藥、薤白提取物按20mg.kg-1給藥、桂枝提取物按15mg.kg-1給藥、干姜提取物按10mg.kg-1給藥、附子提取物按20mg.kg-1給藥、丹參提取物按10mg.kg-1給藥、瓜蔞提取物按10mg.kg-1給藥、地鱉蟲提取物按10mg.k

4、g-1給藥、大黃提取物按10mg.kg-1給藥、普羅布考組按10mg.kg-1給藥；每日1次，連續(xù)給藥16周。
　　 于實驗16周末禁食16h后，麻醉動物，腹主動脈取血后，分離頸總動脈，在主動脈弓起始段取0.5cm主動脈標本，10％多聚甲醛溶液固定12小時；打開腹腔，分離血管外脂肪組織，沿主動脈背部正中線剪開，生理鹽水沖洗，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?；取?ml留置2管，分別分離血清，保存在-80℃低溫冰箱備用。
　　 通

5、過HE染色、油紅O染色分析病理變化和脂質(zhì)沉積情況；用實時熒光定量PCR技術(shù)、Western Blot檢測TLR4、LXR在AS大鼠腹主動脈中的表達；免疫組化法檢測JNK/P-JNK、P38MAPK/p-p38 MAPK在AS大鼠腹主動脈中的表達，用ELISA法檢測ERK1/2/P-ERK1/2的表達，用Western Blot檢測P38MAPK/p-p38 MAPK在AS大鼠腹主動脈中的表達；用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測AS大鼠腹主動脈

6、血管AGTR1mRNA的表達；采用免疫組化法、Western Blot檢測AS大鼠腹主動脈NFκBP65/p-NFκB P65的表達；用ELISA法、免疫組化法、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測AS大鼠腹主動脈血管IL-6的表達；Western Blot檢測AS大鼠腹主動脈JAK1/p-JAK1、STAT3/p-STAT3的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.對AS大鼠動脈血管壁組織形態(tài)的影響將主動脈標本用70％乙醇、85％乙醇、

7、95％乙醇、無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，蠟塊包埋，制成石蠟切片(5μ m)、HE染色，觀察動脈管壁形態(tài)學變化。
　　 HE染色結(jié)果提示，空白模型組大鼠血管中膜及外膜分界不清，中膜增生明顯，內(nèi)膜增厚，不光滑，內(nèi)皮細胞損傷脫落且連續(xù)缺失，可見斑塊突出管腔，斑塊內(nèi)含有大量的巨噬細胞，平滑肌細胞和膠原含量相對較少；蔥白提取物組內(nèi)膜增厚程度相對較輕，內(nèi)皮細胞排列較整齊，彈力膜連續(xù)無斷裂，斑塊亦無破裂；薤白提取物組中膜增生相對較輕，內(nèi)皮細

8、胞排列相對整齊，彈力膜可見斷裂，亦見斑塊破裂；附子提取物組、丹參提取物組和地鱉蟲提取物組見膠原增生明顯，中膜增厚，結(jié)構(gòu)不清晰，丹參組相對較輕；桂枝提取物組見內(nèi)膜增厚，不光滑，內(nèi)皮細胞損傷脫落；干姜提取物組外膜明顯增厚，結(jié)構(gòu)不清晰，內(nèi)皮細胞損傷脫落，斑塊破裂；瓜蔞提取物組中膜增生明顯，內(nèi)膜不光滑，內(nèi)皮細胞損傷脫落，見炎性浸潤；大黃提取物組增生不明顯，內(nèi)膜相對光滑，內(nèi)皮細胞完整，平滑肌細胞排列整齊；普羅布考組增生不明顯，內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞完

9、整且沒有破損，但見少許膠原增生。
　　 將固定的腹主動脈標本用蒸餾水沖洗后，用油紅O染色，分析組織切片中的中性甘油三脂，脂質(zhì)以及脂蛋白等脂質(zhì)狀況。
　　 油紅O進行染色結(jié)果顯示，模型大鼠腹主動脈血管壁有大量的脂質(zhì)沉積，血管壁脂肪含量顯著增加。普羅布考組早期干預治療具有明顯的降脂作用，脂質(zhì)沉積最少。和其它干預組比較，通陽中藥蔥白提取物組和薤白提取物組血管壁中脂質(zhì)沉積也明顯減少，蔥白提取物組減少更明顯?；抵兴幑鲜V提取物組有

10、大量脂質(zhì)沉積。
　　 2.TLR4、Lilt在AS大鼠腹主動脈中的表達正常對照組比較空白模型組大鼠腹主動脈TLR4蛋白水平顯著升高；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可降低TLR4蛋白水平，各干預組抑制率分別為：干姜提取物組為73.11％、大黃提取物組為71.77％、地鱉蟲提取物組為71.29％、普羅布考組為68.56％、桂枝提取物組為54.03％、瓜蔞提取物組為49.70％、附子提取物組為49.11％、蔥白提取物組為48.38％

11、、丹參提取物組為47.31％、薤白提取物組為40.19％。
　　 與正常對照組比較，模型組大鼠腹主動脈TLR4mRNA顯著升高，擴增倍數(shù)為57.27；與空白模型大鼠組比較，各干預組TLR4mRNA表達均有降低，各組基因擴增倍數(shù)的變化為：桂枝提取物組為0.42、地鱉蟲提取物組為0.96、瓜蔞提取物組為4.03、丹參提取物組為5.97、普羅布考組為6.68、薤白提取物組為7.28、干姜提取物組為10.31、附子提取物組為16.98、

12、蔥白提取物組為37.33、大黃提取物組為52.81。
　　 與正常對照組比較，模型組大鼠腹主動脈LXR蛋白顯著降低；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可升高LXR蛋白水平，各干預組增長率分別為：地鱉蟲提取物組為212.64％、瓜蔞提取物組為205.73％、薤白提取物組為187.90％、干姜提取物組為147.31％、桂枝提取物組為136.91％、丹參提取物組為94.00％、附子提取物組為92.83％、蔥白提取物組為67.60％、大黃

13、提取物組為55.92％、普羅布考組為42.36％。
　　 與正常對照組比較，模型組大鼠腹主動脈LXRmRNA明顯降低，擴增倍數(shù)為1.00；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可升高LXRmRNA水平，各干預組增長率分別為：薤白提取物組為11.12、蔥白提取物組為9.40、地鱉蟲提取物組為7.16、干姜提取物組為2.11、丹參提取物組為1.52、普羅布考組為1.22、桂枝提取物組為0.81、瓜蔞提取物組為0.69、大黃提取物組為0.5

14、6、附子提取物組為0.47。
　　 3.對AS大鼠腹主動脈JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2、P38MAPK/p-p38MAPK表達的影響磷酸化前，與正常對照組比較，空白模型組大鼠腹主動脈JNK表達顯著增高，各干預組對JNK的抑制率分別為：瓜蔞提取物組為77％、干姜提取物組為74％、附子提取物組為74％、薤白提取物組為72％、桂枝提取物組為64％、地鱉蟲提取物組為65％、蔥白提取物組為63％、大黃提取物組為55.

15、92％、丹參提取物組為51％、普羅布考組為42.36％；磷酸后，與正常對照組比較，空白模型組大鼠腹主動脈P-JNK表達顯著增高；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可降低P-JNK水平，各干預組抑制率分別為：瓜蔞提取物組為82.30％、大黃提取物組為71-92％、桂枝提取物組為71-78％、附子提取物組為70.09％、普羅布考組為67.91％、薤白提取物組為67.77％、丹參提取物組為67.71％、蔥白提取物組為67.37％、干姜提取物組為

16、66.63％、地鱉蟲提取物組60.11％。
　　 磷酸化前，與正常對照組比較，空白模型組大鼠血清ERK1/2表達顯著增高，各干預組對ERK1/2的抑制率分別為：地鱉蟲提取物組46.47％、附子提取物組為40.70％、干姜提取物組為37.86％、瓜蔞提取物組為32.05％、丹參提取物組為28.41％、大黃提取物組為27.50％、薤白提取物組為25.62％、桂枝提取物組為24.47％。蔥白提取物組為13.29％、普羅布考組為12.7

17、0％；磷酸后，與正常對照組比較，空白模型組大鼠腹主動脈P-ERK1/2表達顯著增高；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可降低P-ERK1/2水平，各干預組抑制率分別為：丹參提取物組為83.53％、附子提取物組為76.91％、大黃提取物組為73.09％、瓜蔞提取物組為65.46％、地鱉蟲提取物組59.64％、桂枝提取物組為59.44％、薤白提取物組為53.62％、干姜提取物組為46.98％、蔥白提取物組為42.57％、普羅布考組為34.54

18、％。
　　 磷酸化前，與正常對照組比較，空白模型組大鼠血清P38MAPK表達顯著增高，各干預組對P38MAPK的抑制率分別為：地鱉蟲提取物組46.47％、附子提取物組為40.70％、干姜提取物組為37.86％、瓜蔞提取物組為32.05％、丹參提取物組為28.41％、大黃提取物組為27.50％、薤白提取物組為25.62％、桂枝提取物組為24.47％、蔥白提取物組為13.29％、普羅布考組為12.70％；磷酸后，與正常對照組比較，空

19、白模型組大鼠腹主動脈p-p38MAPK表達顯著增高；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可降低p-p38MAPK水平，各干預組抑制率分別為：附子提取物組為82％、干姜提取物組為78％、普羅布考組為76％、桂枝提取物組為68％、大黃提取物組為67％、丹參提取物組為43％、地鱉蟲提取物組40％、薤白提取物組為25％、瓜蔞提取物組為27％、蔥白提取物組為17％。
　　 4、對AS大鼠腹主動脈AGTR1表達的影響與正常對照組比較，模型組大鼠

20、腹主動脈AGTR1mRNA表達顯著升高；與空白模型大鼠組比較，各治療組均可升高AGTR1mRNA水平，各干預組擴增倍數(shù)分別為：薤白提取物組為11.12、蔥白提取物組為9.40、地鱉蟲提取物組7.16、干姜提取物組為2.11、丹參提取物組為1.52、普羅布考組為1.22、桂枝提取物組為0.81、瓜蔞提取物組為0.69、大黃提取物組為0.56、附子提取物組為0.47。
　　 5.對AS大鼠腹主動脈NFκ B P65/p-NFκ B表

21、達的影響與正常對照組比較，模型組大鼠腹主動脈p-NFκ B P65表達明顯增高(P<0.01)，干預治療后，各給藥組均可以降低p-NFκ B P65磷酸化程度。組間比較，普羅布考組作用最好，通下中藥大黃提取物組次之，其余各組抑制磷酸化的作用依次是活血化瘀中藥丹參提取物、通絡中藥地鱉蟲提取物、通陽中藥蔥白提取物、通陽中藥薤白提取物、化痰中藥瓜蔞提取物、通陽中藥桂枝提取物和通陽中藥附子提取物。
　　 與正常對照組比較，模型組大鼠腹主

22、動脈p-NFκ B P65含量顯著降低(P<0.05)；與空白模型組比較，通陽中藥蔥白提取物和薤白提取物磷酸化程度升高，普羅布考組、通下中藥大黃提取物和化痰中藥瓜蔞可以明顯降低磷酸化水平，通陽中藥干姜提取物和桂枝提取物次之，通陽中藥附子提取物和活血化瘀中藥丹參提取物無明顯改善。
　　 6.對AS大鼠IL-6表達的影響與正常對照組比較，模型組大鼠IL-6值明顯升高(P<0.01)；與空白模型組比較，通陽中藥蔥白提取物、桂枝提取物組

23、、干姜提取物組、薤白提取物組、通下中藥大黃提取物組和普羅布考組IL-6水平明顯降低(P<0.01)，活血化瘀中藥丹參提取物組、通陽中藥附子提取物、化痰中藥瓜蔞提取物和通絡中藥地鱉蟲提取物組均沒有顯著差異(P>0.05)，其余各組均有明顯降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；和大黃提取物組比較，沒有顯著差異(P>0.05)。
　　 空白模型大鼠腹主動脈血管IL-6的表達明顯升高；與空白模型組比較，各治療組均可降低IL-6的水平(P

24、<0.01)；通絡中藥地鱉蟲提取物降低最為顯著，其余各組依次為：化痰中藥瓜蔞提取物、通陽中藥附子提取物、通陽中藥薤白提取物、活血化瘀中藥丹參提取物、通陽中藥蔥白提取物、通陽中藥干姜提取物、普羅布考、通陽中藥桂枝提取物；普羅布考作用和通陽中藥桂枝提取物沒有顯著差異。
　　 空白模型大鼠腹主動脈血管IL-6mRNA的表達明顯升高；與模型組比較，各治療組均可降低IL-6的水平(P<0.05，P<0.01)；化痰中藥瓜蔞提取物和通下中藥

25、大黃提取物作用最明顯，其余各組依次排序為：通陽中藥干姜提取物、通陽中藥附子提取物、通陽中藥蔥白提取物、普羅布考。
　　 7.對AS大鼠腹主動脈JAK1/p-JAK1、STAT3/p-STAT3表達的影響與正常對照組比較，空白模型組大鼠腹主動脈p-JAK1水平顯著提高(P<0.01)；與空白模型組比較，各干預治療組均可顯著降低p-JAK1水平，其中通陽中藥干姜提取物組效果最好，其余各組的作用依次是：通陽中藥干姜提取物組、通陽中藥薤

26、白提取物組、通下中藥大黃提取物組、活血化瘀中藥丹參提取物組、普羅布考組、通陽中藥桂枝提取物組、化痰中藥瓜蔞提取物組、通絡中藥地鱉蟲提取物組、通陽中藥蔥白提取物組。
　　 與正常對照組比較，模型組大鼠腹主動脈p-STAT3水平明顯降低(P<0.01)；與空白模型組比較，通陽中藥蔥白提取物p-STAT3水平明顯升高，其他各組升高p-STAT3的作用依次為，通陽中藥薤白提取物次之，活血化瘀中藥丹參提取物、化痰中藥瓜蔞提取物、通絡中藥地

27、鱉蟲提取物、通下中藥大黃提取物作用相當，通陽中藥桂枝提取物作用最小。
　　 結(jié)論：
　　 1.辛溫通陽中藥蔥白防治AS的炎癥免疫機制主要與激活AngⅡ及受體AGTR1mRNA表達，影響JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路有關。
　　 2.辛溫通陽中藥蔥白防治AS的非炎癥免疫機制主要通過降低TLR4及TLR4mRNA的水平，升高LXR及LXRmRNA，維持二者之間的平衡，抑制MAPKS家族亞族的JNK、p38MAPK、

28、ERK1/2的磷酸化，作用于和轉(zhuǎn)錄因子NFκB，引起瀑布式反應，促進炎癥因子IL-6的分泌，影響JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路。
　　 3.辛溫通陽中藥蔥白提取物、薤白提取物、桂枝提取物、干姜提取物、附子提取物，活血化瘀中藥丹參提取物，化痰中藥瓜蔞提取物，通絡中藥地鱉蟲提取物和通下中藥大黃提取物均可以影響IL-6/STAT3信號通路中相關的細胞因子的表達，具有防治AS的作用。但是由于作用環(huán)節(jié)和作用靶點的不同，藥物成分的復雜性，