高切高脂通過VEGF-VEGFR2信號通路調(diào)控血管新生參與動脈粥樣易損斑塊形成.pdf

1、目前的研究和臨床表明，位列全球死亡人數(shù)的前兩位的疾病分別為缺血性心臟病和腦血管疾病，高達(dá)死亡人數(shù)的21.9％。伴隨全國人民生活水平的提高，心腦血管疾病已經(jīng)躍居為我國的第一位殺手。冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病最顯著的特征是冠狀動脈的不穩(wěn)定斑塊破裂，形成血栓堵塞冠狀動脈。因此，對預(yù)防冠狀動脈粥樣硬化最重要的手段是早期預(yù)判和治療不穩(wěn)定性易損斑塊。冠狀動脈粥樣硬化病理學(xué)研究表明，易損斑塊具有以下組織病理學(xué)特征:在血管狹窄處容易形成較大的斑塊;斑塊中有薄

2、的纖維帽;炎癥細(xì)胞和大的脂核浸潤；斑塊內(nèi)有較多的新生血管。動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)出現(xiàn)的病理性新生血管,能加速粥樣硬化病變的發(fā)展,從而誘發(fā)斑塊破裂脫落，形成血栓堵塞血管，促進(jìn)其急性心血管事件的發(fā)生。
　　研究報道指出，AS（Atherosclerosis）易損斑塊的形成和破裂的病理原因，一直沒能完全闡述明白，尤其是在高脂和變化的應(yīng)力場環(huán)境下的趨勢更是無法解釋清楚。而有觀點(diǎn)指出，滋養(yǎng)血管增生以及在斑塊內(nèi)高密度富集，是其核心關(guān)鍵點(diǎn)。此時

3、出現(xiàn)的滋養(yǎng)血管，其功能和結(jié)構(gòu)不完整，尤其外膜的不穩(wěn)定，極易發(fā)生側(cè)漏，從而誘發(fā)斑塊內(nèi)出血和破損出現(xiàn)。因而本文從斑塊內(nèi)血管新生入手，探索AS易損斑塊形成、發(fā)展的病因；引入高脂環(huán)境和高切應(yīng)力因素，研究損傷血管在復(fù)雜環(huán)境下，斑塊內(nèi)血管新生與其病變過程之間的關(guān)系。
　　VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）是特異性和作用最強(qiáng)的血管新生因子，參與了多種體內(nèi)的病理性血管新生，在腫瘤和斑塊血管新生中起著關(guān)

4、鍵調(diào)控蛋白的作用。在腫瘤血管新生的研究中，已經(jīng)系統(tǒng)的探索了VEGF及下游通路蛋白在腫瘤病變中的作用機(jī)理。然而在AS易損斑塊的研究中，只是證實(shí)了VEGF參與了斑塊的病變和血管新生過程，但是對于VEGF影響斑塊血管新生的機(jī)理、下游調(diào)控蛋白在AS斑塊中的作用、以及與AS易損斑塊的高危因素高脂高切應(yīng)力之間的關(guān)系研究，還無準(zhǔn)確的定論?；诖耍疚耐ㄟ^對血管新生經(jīng)典通路VEGF-VEGFR2-FAK（Focal adhesion kinase）/p

5、axillin在oxLDL（Oxidized low density liporprotein）和高切應(yīng)力介導(dǎo)的血管新生中的作用研究，明確了VEGF及下游通路蛋白在AS易損斑塊形成中的作用機(jī)制，為臨床治療AS貢獻(xiàn)了新的基因靶點(diǎn)。
　　本論文中，我們使用的動物模型為小鼠左頸總動脈套環(huán)模型。在此基礎(chǔ)上給小鼠飼喂高脂飼料（1%膽固醇和5%豬油），進(jìn)而研究斑塊的組成、血管新生數(shù)量。通過血管新生抑制劑（TNP-470）對模型組注射治療，研究

6、治療組斑塊的形成和血管新生情況。從動物模型上，證明血管新生能促進(jìn)動脈粥樣硬化易損斑塊的形成。在正常組和模型組血管中分別對血管新生相關(guān)基因VEGF、CD31（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1）進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)模型組中VEGF和CD31表達(dá)都集中在斑塊的肩部和纖維帽區(qū)域（較正常組）。并通過合成VEGFsiRNA、VEGFR1siRNA、VEGFR2siRNA、VEGF重組蛋白對高脂

7、高切應(yīng)力影響下的內(nèi)皮細(xì)胞刺激，觀察下游通路蛋白FAK/paxillin的活化（磷酸化），以及對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成的影響，來探索高脂高切應(yīng)力介導(dǎo)下的斑塊血管新生的信號傳導(dǎo)途徑。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?、贅?gòu)建小鼠左頸動脈套環(huán)模型，右側(cè)頸動脈進(jìn)行假手術(shù)對照。單一套環(huán)模型只能刺激內(nèi)膜增生，不誘導(dǎo)易損斑塊的形成。其中增生的體積在高低切應(yīng)力區(qū)域基本一致。加入高脂因素，左頸動脈高切應(yīng)力區(qū)域（狹窄近心端）出現(xiàn)大量不穩(wěn)定斑塊，

8、低切應(yīng)力區(qū)域（遠(yuǎn)心端）無斑塊形成，僅有一定內(nèi)膜增生。而正常組血管，在高脂環(huán)境下，其血管壁有少量脂肪顆粒沉積和內(nèi)膜增生。通過HE染色，顯示高切應(yīng)力區(qū)域易損斑塊內(nèi)的新生血管主要為外膜不完整、內(nèi)皮細(xì)胞有凋亡趨勢、管腔內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤的易泄漏微血管。而TNP-470治療組，血管內(nèi)膜增生減弱，易損斑塊中的血管新生有所減弱,斑塊面積減少。
　?、谕ㄟ^對小鼠頸動脈進(jìn)行血管新生相關(guān)蛋白VEGF、CD31免疫染色。發(fā)現(xiàn)在正常組中，血管無VEGF

9、、CD31的陽性表達(dá)。而模型組高切應(yīng)力組中，VEGF、CD31在斑塊的肩部和纖維帽區(qū)域都存在陽性高表達(dá)。研究顯示，VEGF參與了斑塊血管新生的病理過程，從而為我們選擇VEGF作為關(guān)于血管新生的研究靶點(diǎn)提供了依據(jù)。
　?、弁ㄟ^用oxLDL和切應(yīng)力分別刺激HUVECs（Human umbilical vascular endothelial cell）,研究兩者對HUVECs遷移和管腔形成的影響。發(fā)現(xiàn)正常組內(nèi)皮細(xì)胞無遷移和管腔形成。而

10、oxLDL組內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成明顯，其中最佳濃度為20μg/mL。高切應(yīng)力組內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成明顯，最佳壓力為25dyn/cm2。研究顯示，oxLDL和高切應(yīng)力能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能主導(dǎo)的血管新生。
　?、芡ㄟ^合成VEGFsiRNA、VEGF重組蛋白對高脂高切應(yīng)力影響下的內(nèi)皮細(xì)胞刺激，研究VEGF在oxLDL和高切應(yīng)力介導(dǎo)的血管新生中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF的過表達(dá)，能促進(jìn)HUVECs遷移和管腔形成；同時高脂高切應(yīng)力都能

11、促進(jìn)HUVECs中VEGF及下游受體（VEGFR1、VEGFR2）的過表達(dá)；VEGFsiRNA組內(nèi)皮細(xì)胞用oxLDL和高切應(yīng)力刺激，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成明顯減少（較oxLDL和高切應(yīng)力組）。研究顯示，VEGF是oxLDL和高切應(yīng)力調(diào)控血管新生的關(guān)鍵蛋白。
　?、萃ㄟ^合成VEGFR1siRNA、VEGFR2siRNA、VEGF重組蛋白、VEGFsiRNA對高脂高切應(yīng)力影響下的內(nèi)皮細(xì)胞刺激，研究VEGF-VEGFR2-FAK/pa

12、xillin信號通路在oxLDL和高切應(yīng)力介導(dǎo)的血管新生中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，VEGF能調(diào)控VEGFR2下游蛋白FAK/paxillin的磷酸化；oxLDL和高切應(yīng)力通過VEGF調(diào)控VEGFR2-FAK/paxillin下游信號通路的表達(dá)；同時VEGFR2能調(diào)控下游蛋白FAK/paxillin的磷酸化;VEGFR2/VEGFR1是VEGF調(diào)控血管新生的關(guān)鍵因子。因此，在高脂高切應(yīng)力調(diào)控的血管新生中，VEGF-VEGFR2-FAK/pa