轉(zhuǎn)蘿卜過氧化物酶基因RsPrx1酶母表達(dá)條件優(yōu)化及其抗性機理研究.pdf

1、植物過氧化物酶的功能多樣,在植物的生長過程中發(fā)揮著重要的作用,目前采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究植物過氧化物酶功能是較為熱門的課題,一方面更深入的了解了目的基因的功能,另一方面也為目的基因的工業(yè)化應(yīng)用提供了理論依據(jù)。本實驗選用已經(jīng)成功構(gòu)建轉(zhuǎn)蘿卜過氧化物酶基因RsPrxl的酵母菌株(GSRP25)為研究對象,在本實驗室前期的研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)基優(yōu)化,即在培養(yǎng)基中添加血紅素0.5g/L,當(dāng)培養(yǎng)時間到達(dá)80h左右時向培養(yǎng)基中加入0.5ml

2、/L微量元素混合物(0.5g/L MgCl2、30g/LFeCl2·6H2O、1g/L ZnCl2·4H2O、0.2g/L,CoCl2·6H2O、1g/L Na2MoO4·2H2O、0.5g/LCaCl2·2H2O、1g/L CuCl2和0.2g/L H2BO3),在經(jīng)過優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)下GSRP25的最大分泌過氧化物酶酶活達(dá)到30.9U/ml,是優(yōu)化前培養(yǎng)基所獲得酶活量的5.92倍,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測出目的條帶的表達(dá)量也相對

3、顯著增強。
　　 其次,對轉(zhuǎn)基因酵母GSRP25進(jìn)行抗性方面的研究,本實驗選擇誘導(dǎo)(BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng))-不誘導(dǎo)(YPD培養(yǎng)基培養(yǎng))和不誘導(dǎo)(YPD培養(yǎng)基培養(yǎng))-誘導(dǎo)(BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng))兩種培養(yǎng)條件,觀察NaCl、H2O2、溫度等變化時,GSRP25的抗性變化。實驗結(jié)果表明:誘導(dǎo)—不誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)蘿卜過氧化物酶RsPrxl酵母的抗鹽、抗氧化及抗高溫和低溫功能高于不誘導(dǎo)—誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。其中,抗鹽和抗高溫功能最強。因此,不僅證明

4、了誘導(dǎo)—不誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是研究外源基因功能的最佳培養(yǎng)條件,而且揭示了外源蘿卜過氧化物酶RsPrxl作為植物體內(nèi)的保護(hù)酶體系,具有抗鹽、抗氧化以及抗高溫的作用。
　　 高鹽環(huán)境一直是人們關(guān)注的重要的脅迫因子之一,對酵母開展鹽脅迫機理研究也是生物學(xué)研究的熱點之一。但目前對釀酒酵母脅迫機制已經(jīng)有了較為深入的了解,而對巴斯德畢赤酵母的相關(guān)研究報道甚少,本實驗以轉(zhuǎn)蘿卜過氧化物酶基因RsPrxl畢赤酵母GSRP25為研究對象,對其進(jìn)行抗鹽方面

5、的深入研究。從菌液濃度(OD600)、POD酶活和可溶性蛋白含量等生理生化指標(biāo)可以看出轉(zhuǎn)基因酵母GSRP25的抗鹽脅迫能力要強于野生型的畢赤酵母GS115。從代謝機理分析,高鹽脅迫會對酵母細(xì)胞產(chǎn)生兩方面的毒害,一是Na+離子毒害,二是滲透壓脅迫,為進(jìn)一步研究其作用機制,本實驗選擇不同鹽濃度、不同處理時間作用于兩種菌株,并提取酵母總RNA,采用半定量RT-PCR的方法進(jìn)行抗性基因表達(dá)鑒定,結(jié)果證明:抗性基因HSP12、ALD3在兩種菌株中