過量atRA對胎鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  探討過量全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)小鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。
  方法:
  取周齡為10周左右的SPF級(jí)C57BL/6J近交系小鼠(雌鼠40只,雄鼠20只),于前一天晚8時(shí)按雌雄比2:1進(jìn)行合籠交配。以次日早晨觀察到陰栓陽性的雌鼠標(biāo)記為妊娠0天(gestation day0, GD0),共獲得30只孕鼠,隨機(jī)分組后,每組15只。在GD10時(shí),實(shí)驗(yàn)

2、組以一次性灌胃給藥的方式給予孕鼠100mg/kg的atRA,對照組孕鼠灌以等量玉米油。分別取兩組GD13、14、15和16時(shí)灌胃時(shí)點(diǎn)的胎鼠標(biāo)本,利用HE染色連續(xù)觀察胎鼠腭板發(fā)育情況。
  我們建立GD13胎鼠腭突間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)模型,利用生長狀態(tài)較好的第三代胎鼠腭間充質(zhì)(mouse embryonic palate mesenchymal, MEPM)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),根據(jù)atRA作用濃度,實(shí)驗(yàn)共分為5組(0.1μmol/L、0

3、.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L),并設(shè)空白對照組。atRA作用時(shí)間分別為:24h、48h和72h。利用臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT法檢測atRA對MEPM細(xì)胞活性的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系,由此結(jié)合 RA的臨床藥理特點(diǎn),選擇適宜的時(shí)間和濃度,進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。利用Real-time PCR檢測過量atRA對Smad2、Smad7 mRNA表達(dá)的影響, Western blot方法檢測過量atRA對MEPM細(xì)胞內(nèi)

4、蛋白Smad2、Smda7和p-Smad2蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為雙側(cè)α=0.05。
  結(jié)果:
  HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:對照組GD13、14、15和16胎鼠雙側(cè)腭板完成上抬、接觸及融合過程;而與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組 GD13胎鼠雙側(cè)腭板體積較小,且并未觀察到雙側(cè)腭板上抬;GD14時(shí),實(shí)驗(yàn)組胎鼠雙側(cè)腭板未上抬,可觀察到發(fā)育明顯延遲;GD15時(shí),實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)腭板仍未發(fā)生接觸,最終在

5、GD16時(shí)觀察到實(shí)驗(yàn)組胎鼠兩側(cè)腭板形成腭裂。
  臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,隨atRA作用時(shí)間及濃度增加細(xì)胞拒染率逐漸降低,提示隨atRA作用時(shí)間及濃度增加,細(xì)胞活性逐漸下降;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:atRA濃度在0.1-10μmol/L范圍內(nèi),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,MEPM細(xì)胞吸光度值為遞減趨勢,MEPM細(xì)胞活性隨著atRA濃度增加細(xì)胞活性逐漸下降,尤其是加藥72小時(shí)后,細(xì)胞增殖明顯受到抑制,并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。我們利用SPSS17.0分

6、析得到atRA作用72小時(shí)對MEPM細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為:4.76μmol/L。實(shí)時(shí)定量Real-time PCR結(jié)果顯示,與對照組比,實(shí)驗(yàn)組(5μmol/L atRA)可促進(jìn)Smad7 mRNA的表達(dá)(P<0.05),而對Smad2 mRNA表達(dá)無影響(P>0.05);Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,5μmol/L atRA可下調(diào) p-Smad2蛋白的表達(dá),促進(jìn)Smad7蛋白表達(dá),但對Smad2蛋白表達(dá)并無影響(P

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