YKL-40分子對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞體外遷移能力和化療敏感性的影響.pdf

1、卵巢癌是婦科三大常見惡性腫瘤之一，上皮性卵巢癌(EOC)為主要病理類型（85％以上），死亡率高居女性腫瘤相關(guān)性死亡之首。上皮性卵巢癌惡性程度高，早期癥狀隱匿，且極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，致使70％的患者在確診時(shí)即已出現(xiàn)盆腹腔器官的侵襲播散和（或）遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移。目前，最大程度的外科減瘤術(shù)和術(shù)后鉑類、紫杉醇的聯(lián)合化療是上皮性卵巢癌的主要治療手段，并可使大部分的患者獲得緩解。但仍有75％-80％的晚期患者在治療后復(fù)發(fā)，并在之后進(jìn)行的重復(fù)循環(huán)的化療過

2、程中發(fā)生獲得性耐藥，出現(xiàn)對(duì)鉑類等一線化療方案藥物敏感性的降低。上皮性卵巢癌的高侵襲轉(zhuǎn)移特性以及耐藥的出現(xiàn)，是阻礙患者預(yù)后、導(dǎo)致患者高死亡率的重要原因，嚴(yán)重威脅了女性的健康。因此，探討并闡明影響卵巢癌轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥的參與分子和機(jī)制具有重要意義。
　　YKL-40，又被稱作殼質(zhì)酶3樣1(CHI3L1)，是一種分泌型糖蛋白，在乳腺癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá)。研究表明，YKL-40可通過多種機(jī)制參與惡性腦膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌等

3、腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。另有研究證實(shí)，YKL-40分子可通過AKT/ERK通路介導(dǎo)耐替莫唑胺(TMZ)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(TMZ-R U87)對(duì)替莫唑胺的耐藥。然而，YKL-40是否可影響EOC細(xì)胞的遷移能力及對(duì)鉑類藥物的敏感性，還尚不明確。
　　本研究選用經(jīng)典的EOC細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞作為研究對(duì)象，共分三個(gè)部分，分別從體外驗(yàn)證YKL-40分子對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的遷移能力以及鉑類藥物敏感性的影響，并探討相關(guān)調(diào)控因子。
　　

4、第一部分YKL-40在卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的表達(dá)
　　[目的]檢測EOC細(xì)胞SKOV-3中YKL-40分子的表達(dá)。
　　[方法]選用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞作為陽性對(duì)照，采用RT-PCR、ELISA、Western Blot試驗(yàn)，分別從mRNA和蛋白水平檢測SKOV-3細(xì)胞中YKL-40的表達(dá)水平。
　　[結(jié)果]在陽性對(duì)照U87細(xì)胞中，RT-PCR及ELISA可檢測到Y(jié)KL-40的顯著表達(dá)，其瓊脂糖凝膠電泳可見YKL-

5、40 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物，細(xì)胞上清分泌水平的表達(dá)量為(18.41±1.69)ng/mL;而在SKOV-3細(xì)胞，無論mRNA水平還是分泌蛋白水平，均未檢測到Y(jié)KL-40的表達(dá)。
　　[結(jié)論]YKL-40在SKOV-3細(xì)胞無明顯表達(dá)。
　　第二部分YKL-40對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞體外遷移能力的影響
　　[目的]探討YKL-40對(duì)EOC細(xì)胞SKOV-3體外遷移能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制。
　　[方法]根據(jù)第一部分檢測結(jié)

6、果，構(gòu)建YKL-40過表達(dá)慢病毒，采用慢病毒感染的方法構(gòu)造過表達(dá)YKL-40的SKOV-3細(xì)胞株LV-SKOV-3細(xì)胞，和空載體陰性對(duì)照細(xì)胞株NC-SKOV-3，qRT-PCR、ELISA、Western Blot驗(yàn)證YKL-40過表達(dá)情況;Transwell試驗(yàn)檢測YKL-40過表達(dá)對(duì)SKOV-3遷移能力的影響;特異性抑制劑阻滯過表達(dá)細(xì)胞中p38 MAPK通路，檢測細(xì)胞遷移能力的改變。
　　[結(jié)果]
　　1.成功構(gòu)建YKL

7、-40過表達(dá)細(xì)胞株LV-SKOV-3及空載體陰性對(duì)照細(xì)胞株NC-SKOV-3。qRT-PCR、ELISA、Western Blot檢測到LV-SKOV-3細(xì)胞YKL-40表達(dá)顯著增強(qiáng)，其mRNA的相對(duì)表達(dá)量為NC-SKOV-3細(xì)胞的9.89倍，蛋白分泌量達(dá)(32.35±1.38) ng/ml，為NC-SKOV-3細(xì)胞的17.43倍。
　　2.LV-SKOV-3細(xì)胞的遷移數(shù)量平均為(255.75±12.75)個(gè)/視野，NC-SKOV

8、-3細(xì)胞為(119.25±13.25)個(gè)/視野。LV-SKOV-3細(xì)胞的遷移數(shù)量上調(diào)為空載體陰性對(duì)照細(xì)胞的1.14倍。
　　3.抑制p38 MAPK通路，可部分下調(diào)LV-SKOV-3的遷移能力。Transwell試驗(yàn)結(jié)果示，抑制劑組LV-SKOV-3細(xì)胞的遷移數(shù)量較DMSO對(duì)照組減少，為對(duì)照組的63.30％。
　　[結(jié)論]YKL-40分子可顯著增強(qiáng)上皮性卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的遷移能力，且這一作用可能是通過p38 MAPK通

9、路介導(dǎo)的。
　　第三部分YKL-40對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞化療藥物敏感性的影響
　　[目的]探討YKL-40對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞鉑類藥物敏感性的影響及相關(guān)分子機(jī)制。
　　[方法]Western Blot試驗(yàn)檢測LV-SKOV-3細(xì)胞中NF-KB分子的表達(dá);NF-κB特異性抑制劑、ELISA、Western Blot檢測NF-κB對(duì)SKOV-3細(xì)胞YKL-40蛋白表達(dá)的調(diào)控;分別采用不同濃度（1μg/ml、2.5μ

10、g/ml、5μg/ml、10μg/ml）的順鉑(DDP)處理YKL-40過表達(dá)LV-SKOV-3細(xì)胞和空載體陰性對(duì)照NC-SKOV-3細(xì)胞48h，CCK-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞的抑制率;抑制劑Bay11-7082特異性抑制LV-SKOV-3細(xì)胞中的NF-κB，CCK-8試驗(yàn)再次檢測細(xì)胞LV-SKOV-3對(duì)DDP敏感性的變化。
　　[結(jié)果]
　　1.Western Blot結(jié)果顯示，LV-SKOV-3細(xì)胞中NF-KB蛋白表達(dá)水平較陰性

11、對(duì)照NC-SKOV-3細(xì)胞增高。
　　2.抑制NF-κB分子后，ELISA、Western Blot檢測到LV-SKOV-3細(xì)胞YKL-40的表達(dá)下降，其細(xì)胞上清分泌水平為(25.40±3.30) ng/ml，是DMSO對(duì)照組的0.64倍。其細(xì)胞YKL-40蛋白的相對(duì)表達(dá)量為DMSO組的0.68倍。
　　3.經(jīng)不同濃度DDP處理后，CCK-8檢測均表現(xiàn)為細(xì)胞LV-SKOV-3的抑制率較NC-SKOV-3降低。這說明，YKL-

12、40過表達(dá)可降低DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的殺傷力。
　　4.抑制NF-κB后，在各濃度梯度DDP作用下，抑制劑組LV-SKOV-3細(xì)胞的抑制率較DMSO組增高，但仍低于NC-SKOV-3細(xì)胞組。這說明，抑制NF-κB可部分恢復(fù)順鉑對(duì)SKOV-3細(xì)胞的殺傷力。
　　[結(jié)論]
　　1.NF-κB可調(diào)控上皮性卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中YKL-40的表達(dá)。
　　2.YKL-40可降低上皮性卵巢癌SKOV-3細(xì)胞鉑類藥