iTRAQ和SWATH技術(shù)在膝骨關(guān)節(jié)炎滑液蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:運(yùn)用iTRAQ和SWATH定量質(zhì)譜技術(shù)比較研究膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)以及半月板損傷患者關(guān)節(jié)滑液蛋白質(zhì)譜的差異，尋找并初步明確KOA關(guān)節(jié)滑液中的特異性生物學(xué)標(biāo)志，為該病的早期診治、療效監(jiān)測和預(yù)后評估提供可靠的、準(zhǔn)確靈敏的實(shí)驗(yàn)室參考指標(biāo)，并進(jìn)一步闡述其發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集2014年6月-2014年9月在解放軍總醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換的10例KOA患者與行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的10例半月板損傷患者(鏡下顯

2、示關(guān)節(jié)軟骨均正常)的滑液標(biāo)本。KOA患者疾病嚴(yán)重程度分級采用Kellgren-Lawrence(KL)放射學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)組KOA患者均為KL4級。采用iTRAQ定量質(zhì)譜技術(shù)分析比較KOA組和半月板損傷組的蛋白質(zhì)譜，初步篩選組間差異蛋白，并對差異蛋白進(jìn)行GO分析、COG分析和通路富集分析。
　　2.另收集行關(guān)節(jié)置換的10例KOA患者和10例RA患者以及行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的10例半月板損傷患者(鏡下顯示關(guān)節(jié)軟骨均正常)的滑液標(biāo)本。根據(jù)

3、KL放射學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)，所有KOA和RA患者均為KL4級。采用SWATH定量質(zhì)譜技術(shù)分析比較KOA組、RA組和半月板損傷組的蛋白質(zhì)譜，篩選KOA組的特異性差異蛋白。對差異蛋白進(jìn)行GO分析和通路富集分析，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量分析部分具有潛在臨床意義的蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.采用iTRAQ定量質(zhì)譜技術(shù)分析比較KOA和半月板損傷患者關(guān)節(jié)滑液的蛋白質(zhì)譜差異，共鑒定出71個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白，其中31個(gè)在KOA

4、滑液中表達(dá)上調(diào)，40個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO分析提示:這些差異蛋白大部分來源于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和大分子復(fù)合物等細(xì)胞成分;其分子功能主要為結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、催化和調(diào)節(jié)活性等;主要參與對刺激的反應(yīng)、生物過程的調(diào)節(jié)及代謝反應(yīng)等生物過程。通路富集分析顯示較多差異蛋白富集于補(bǔ)體和凝集瀑布反應(yīng)通路和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用的生物過程。
　　2.采用SWATH定量質(zhì)譜技術(shù)分析比較KOA、RA和半月板損傷患者關(guān)節(jié)滑液的蛋白質(zhì)譜差異，組間兩兩對比結(jié)果如

5、下:①KOA組vs半月板損傷組:差異蛋白共計(jì)131個(gè)，93個(gè)表達(dá)上調(diào)，38個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中，補(bǔ)體C1r在KOA中上調(diào)最為明顯，脂肪酸結(jié)合蛋白在KOA中下調(diào)最為明顯。②RA組vs半月板損傷組:差異蛋白共計(jì)185個(gè)，152個(gè)表達(dá)上調(diào)，33個(gè)表達(dá)下調(diào)。③KOA組vs RA組:差異蛋白共計(jì)139個(gè)，22個(gè)表達(dá)上調(diào)，117個(gè)表達(dá)下調(diào)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得:KOA滑液中特異性差異蛋白共計(jì)28個(gè)，17個(gè)表達(dá)上調(diào)，11個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中，Dickkopf蛋白在

6、KOA滑液中特異性表達(dá)上調(diào)。KOA和RA中表達(dá)趨勢不一致的差異蛋白共計(jì)8個(gè)，3個(gè)在KOA中表達(dá)上調(diào)，RA中表達(dá)下調(diào);5個(gè)在KOA中表達(dá)下調(diào)，RA中表達(dá)上調(diào)。對KOA滑液中131個(gè)差異蛋白進(jìn)行GO分析提示:差異蛋白主要來源于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、分泌顆粒、脂蛋白復(fù)合物等成分;分子功能主要為酶活性、酶抑制劑活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)活性等;主要參與對創(chuàng)傷的急性炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體的活化、免疫應(yīng)答、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持等生物

7、過程。通路富集分析提示補(bǔ)體和凝集瀑布反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)-受體間相互作用以及過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路是差異蛋白參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。經(jīng)ELISA驗(yàn)證，補(bǔ)體C1r、Dickkopf蛋白在KOA滑液中表達(dá)上調(diào)，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān);脂肪酸結(jié)合蛋白在KOA滑液中表達(dá)下調(diào)，且與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.作為非特異性的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，iTRAQ標(biāo)記定量技術(shù)和SWATH非標(biāo)記定量技術(shù)均具靈敏度