甘藍(lán)型油菜株型及角果長(zhǎng)度相關(guān)miRNA和靶基因的挖掘.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類21-24nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA，參與調(diào)控植物的發(fā)育、衰老、死亡及對(duì)各種逆境脅迫響應(yīng)等。株型是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀，與作物的育種潛力，產(chǎn)量，收獲方式息息相關(guān)。雖然有很多基因被報(bào)道參與調(diào)作物控株型，但是油菜中miRNA參與株型調(diào)控的研究還不多。本研究通過高通量測(cè)序手段對(duì)頂端組織和早期發(fā)育的角果中的miRNA和靶基因進(jìn)行挖掘，以期對(duì)株型調(diào)控的分子機(jī)理有一定了解，結(jié)果如下:
　　1.矮桿緊湊型

2、甘藍(lán)型油菜株型相關(guān)miRNA及靶基因的挖掘
　　本課題組發(fā)現(xiàn)了一種棒狀株型油菜突變體，其具有重大的育種潛力。以回交后代中矮桿緊湊株型油菜突變體(rodlike)和正常株型油菜（normal）為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其莖頂端進(jìn)行四個(gè)sRNA組學(xué)測(cè)序（兩次生物學(xué)重復(fù)）和兩個(gè)降解組測(cè)序，挖掘參與調(diào)控株型的miRNAs。對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最終在四個(gè)小RNA文庫中共檢測(cè)到了925個(gè)miRNA前體;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)315個(gè)miRNA前體

3、對(duì)應(yīng)著74個(gè)已知的miRNA歸屬于38個(gè)miRNA家族，610個(gè)miRNA前體歸屬于327個(gè)新的miRNA。對(duì)MIRNA家族成員進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR169家族成員最多，其次是miR156家族，并發(fā)現(xiàn)一些miRNA家族成員在基因組上呈現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)或者隨機(jī)復(fù)制事件。差異miRNA分析結(jié)果得到5個(gè)已知miRNA和4個(gè)novel miRNA在棒狀突變體中顯著上調(diào)表達(dá);另外，5個(gè)已知miRNA和3個(gè)novel miRNA在棒狀突變體中顯著下調(diào)表達(dá)，

4、并通過實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證了miRNAs表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致。
　　利用降解組測(cè)序鑒定到408個(gè)靶基因，其中25個(gè)已知miRNA家族的264個(gè)靶基因和58個(gè)novel miRNAs對(duì)應(yīng)的144個(gè)靶基因。通過5'RACE驗(yàn)證了7個(gè)已知miRNA和1個(gè)novel miRNA的14個(gè)靶基因，證明降解組測(cè)序結(jié)果的可靠性。同時(shí)，挑選了4個(gè)差異miRNAs及其靶基因分析它們之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們呈負(fù)相關(guān)性，表明miRNA-target在頂端起作用。

5、>　　進(jìn)一步分析表明，營(yíng)養(yǎng)元素/金屬離子匱乏，能量供應(yīng)不足，衰老/早熟機(jī)制，還有miR319/miR164調(diào)控的TCP轉(zhuǎn)錄因子參與的分生組織活動(dòng)可能導(dǎo)致頂端分生組織的提前終止。更重要的是轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明TCP4基因能抑制頂端的生長(zhǎng)，導(dǎo)致頂端終止發(fā)育。因此，我們推測(cè)miR319調(diào)控的TCP轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)雙子葉植物株型的調(diào)控起重要的作用。此外，本研究中預(yù)測(cè)到的novel miRNA的功能為油菜中miRNA的研究提供了大量有用數(shù)據(jù)。
　　

6、2.甘藍(lán)型油菜角果長(zhǎng)度相關(guān)miRNA的挖掘
　　本研究對(duì)回交后代中長(zhǎng)角果(LS)和短角果(SS)材料開花0-7天的角果進(jìn)行小RNA測(cè)序，構(gòu)建了4個(gè)小RNA文庫（兩次重復(fù)）。測(cè)序結(jié)果總共鑒定到814個(gè)miRNA前體，其中255個(gè)前體代表36個(gè)miRNA家族的65個(gè)已知miRNA，559個(gè)前體代表394個(gè)novel miRNA。研究發(fā)現(xiàn)novel miRNA中有一些是已知miRNA的變異，如novel_mir_65和novel_mir

7、_80與bna-miR164只有4個(gè)堿基差異，推測(cè)novel miRNA在進(jìn)化上會(huì)越來越少，逐漸趨向于已知miRNAs。長(zhǎng)短角果材料中的差異表達(dá)分析顯示17個(gè)miRNAs在LS和SS中存在顯著差異，進(jìn)一步通過qRT-PCR驗(yàn)證了9個(gè)miRNA定量結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致。
　　構(gòu)建了LS和SS兩個(gè)降解組文庫，總共鑒定到522個(gè)剪切事件，包括33個(gè)已知miRNA介導(dǎo)的371個(gè)剪切事件和58個(gè)novel miRNA介導(dǎo)的151個(gè)剪切事件

8、，且5'RLM-RACE驗(yàn)證的結(jié)果與降解組測(cè)序結(jié)果相符。
　　進(jìn)一步分析了5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs及其靶基因在兩個(gè)材料0，3，5，7DAP角果中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，其中miR160和novel_mir_11在角果發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都下調(diào)表達(dá)，表明這些miRNAs可能對(duì)角果發(fā)育起重要作用。進(jìn)一步研究證實(shí)miR160在角果中有活性，并且在油菜中超量表達(dá)miR160抑制生長(zhǎng)素響應(yīng)因子的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)旺盛，角果長(zhǎng)度增加，揭示了角果長(zhǎng)的發(fā)育